Aujourd'hui, Yaohai a le plaisir de partager son protocole de transcription in vitro pour les ARN longs. Il s'agit d'une stratégie efficace que les scientifiques utilisent souvent pour produire de l'ARN en laboratoire. De cette manière, les chercheurs peuvent produire un nombre considérablement plus important d'ARN longs, ce qui est essentiel pour l'étude dans différents domaines biologiques. Nous fournissons ici un guide étape par étape pour la préparation d'ARN longs via la transcription in vitro. Nous parlerons également de la manière dont nous pourrions améliorer le processus et tenter de résoudre certains des problèmes auxquels vous êtes confrontés lors de la synthèse d'ARN longs.
Plusieurs composants essentiels sont nécessaires à la transcription in vitro, en particulier les ARN longs. Vous devrez fournir une enzyme appelée ARN polymérase, du matériel d'écriture sous forme de nucléotides triphosphates (NTP), un tampon pour faciliter la réaction et un modèle d'ADN. Pour savoir comment procéder étape par étape, vous trouverez un guide détaillé ici :
Plusieurs facteurs sont très importants pour le bon fonctionnement de la synthèse de l'ARN. Le plus important est la quantité d'ions magnésium dans le tampon lui-même. L'ARN polymérase a besoin d'une quantité importante de magnésium pour assurer une interaction correcte avec la matrice d'ADN et le repliement ultérieur de l'ARN. Un deuxième aspect important à prendre en compte est la concentration de la matrice d'ADN. Plus précisément, vous devez avoir suffisamment de réaction de l'ADN de la matrice pour obtenir de bons rendements d'ARN.
Bien entendu, l’ARN long présente son lot de problèmes. Ces problèmes peuvent être liés à la dégradation de l’ARN, affecter la façon dont l’ARN se replie et créer des structures qui peuvent interférer avec la synthèse de l’ARN. Une façon de résoudre ces problèmes est de modifier le tampon que vous prenez. Pour obtenir une structure plus complète de l’ARN, les chercheurs peuvent ajouter différents produits chimiques spéciaux tels que le DTT et le p-mercaptoéthanol pour aider l’ARN à se replier correctement et l’empêcher de se coller ou de s’agglutiner.
De plus, tous les types d'ARN longs ne sont pas identiques et certains peuvent nécessiter des méthodes de synthèse alternatives. Les chercheurs peuvent avoir besoin d'ajouter des caractéristiques spéciales à l'ARN, comme l'ajout d'une coiffe 5 ou d'une queue Poly-A. Si cela est nécessaire (comme expliqué plus loin), les chercheurs doivent inclure d'autres enzymes telles que la guanylyltransférase et la poly(A)polymérase. Il faut également sélectionner une enzyme ARN polymérase appropriée qui leur permet de produire naturellement plus d'ARN. Dès que l'ARN long doit être synthétisé, nous devrons identifier la meilleure condition.
Le protocole de transcription in vitro des ARN longs a de nombreuses applications clés dans le cadre de plusieurs projets de recherche, d'analyse et de thérapie. Il aide les scientifiques à comprendre la structure de l'ARN, son fonctionnement et la manière dont ils peuvent modifier les gènes grâce aux technologies contemporaines. D'autres découvertes récentes, comme la découverte de diverses maladies et de leurs traitements, comme les thérapies à base d'ARN très actuelles, nous permettent de croire à l'utilité de cette technologie de lecture pour la médecine.
L'utilisation de ce protocole présente de nombreux avantages. Une méthode basée sur l'électrophorèse est généralement la méthode la plus efficace et la plus rentable pour produire de grandes quantités d'ARN long. Outre la qualité de l'ARN, un bon rendement est également un facteur important pour les chercheurs afin de les aider dans leurs recherches, en particulier s'ils ont besoin de grandes quantités d'ARN pour les expériences en raison de la quantité importante de matériel d'entrée au départ. De plus, la transcription in vitro pour les ARN longs est généralement plus précise et reproductible que la synthèse chimique ou la synthèse cellulaire d'ARN.
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