mRNA-polyA-Charakterisierung

mRNA 3' Poly(A) Charakterisierung

Der 3'-Poly(A)-Schwanz (Polyadenosine) von mRNA ist ein wesentlicher Bestandteil der posttranskriptionellen Regulation und beeinflusst den Export, die Stabilität und die Translation von mRNA. Bei in vitro transkribierten (IVT) mRNAs wird der Poly(A)-Schwanz entweder während der Co-Transkription mithilfe einer Vorlage oder durch einen enzymatischen Schwanzprozess ohne Vorlage eingeführt. Dieses 3'-Poly(A) dient als kritisches Qualitätsmerkmal (CQA) für IVT-RNAs und erfordert eine gründliche Charakterisierung sowohl während der Prozessentwicklung als auch der Chargenfreigabe.

Yaohai Bio-Pharma bietet spezialisierte Dienstleistungen zur Charakterisierung von 3'-Poly(A) an und verwendet dabei Techniken wie die Spaltung von Ribonuklease T1 (RNase T1), die Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie mit Ionenpaaren (IP-RP-HPLC)/Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS) und umfassende Datenanalyse.

Regulatorische Anforderungen für die mRNA 3' Poly(A) Charakterisierung

Gemäß den regulatorischen Erwägungen der WHO gilt „die Integrität der mRNA-Struktur als kritisches Qualitätsmerkmal für die Freigabe der mRNA. Daher ist eine Kontrolle der mRNA-Integrität, der 5'-Capping-Effizienz, des Vorhandenseins oder der Länge des 3'-Poly(A)-Schwanzes usw. erforderlich.“

Analytische Methode

Verfahren

Schritt 1. RNase T1-Spaltung

Aufgrund ihrer Größe und Heterogenität ist eine direkte Analyse vollständiger intakter mRNA mittels LC-MS nicht praktikabel. Um den Poly(A)-Schwanz zu untersuchen, muss er von der vollständigen mRNA abgespalten werden. Die gängige Methode umfasst eine enzymatische Verdauung mit RNase T1, wobei das 3'-Ende von rG selektiv gespalten wird, während die Poly(A)-Sequenz erhalten bleibt. Die mRNA-Probe wird mit RNase T1 verdaut und Spaltfragmente, die Poly(A)-Abschnitte enthalten, werden mithilfe von Oligo-dT-beschichteten Magnetkügelchen isoliert.

Schritt 2. IP-RP-HPLC/LC-MS

Die extrahierten Enden wurden mittels LC-MS analysiert, was genaue Informationen zur Länge der Enden mit Einzelnukleotidauflösung lieferte. Bei der Oligonukleotid-LC-MS-Analyse sind Ionenpaar-Umkehrphasentrennungen (IP-RP) mit Amin-Zusätzen als mobile Phase aufgrund ihrer robusten Auflösung und Kompatibilität mit Massenspektrometrie (MS) die bevorzugte chromatographische Methode.

Schritt 3. Datenanalyse

Die Länge des Poly(A)-Schwanzes und seine relative Häufigkeit hängen von der Anzahl und Intensität der Peaks geteilt durch die Masse von Adenosin ab. Nach der Verarbeitung oder Dekonvolution des Massenspektrums wird die erwartete Masse eines 100-meren Poly(A)-Schwanzes (33,163 Da im Kasten) erkennbar, begleitet von einer Reihe von Massen im Abstand von 329 amu, was der Masse von Adenosin (A) entspricht.

Beispiel einer 3'-Poly(A)-Charakterisierung mittels LC–MS

Yaohai-BioPharma hat eine robuste Methode zur mRNA-3'-Poly(A)-Charakterisierung entwickelt, einschließlich RNase T1-Spaltung und IP-RP-HPLC/LC-MS.

Yaohai-BioPharma hat eine robuste Methode zur mRNA-3'-Poly(A)-Charakterisierung entwickelt, einschließlich RNase T1-Spaltung und IP-RP-HPLC/LC-MS.