mRNA 5'-Capping-Effizienz
Die Bedeutung der mRNA 5'-Capping-Effizienzanalyse
Die Cap-Struktur am 5'-Ende der mRNA spielt eine entscheidende Rolle bei der effizienten Translation, Stabilisierung und dem Transport von mRNAs innerhalb von Eukaryoten. Im Zusammenhang mit in vitro transkribierter (IVT) mRNA wird die 5'-Cap entweder durch co-transkriptionelle Capping- oder enzymatische Capping-Prozesse eingeführt. Als unverzichtbarer Bestandteil von IVT-RNAs ist die 5'-Cap ein kritisches Qualitätsmerkmal (CQA), das während der gesamten Prozessentwicklung und Chargenfreigabe einer umfassenden Charakterisierung bedarf.
Yaohai-Bio Pharma bietet umfassende Lösungen zur Analyse der 5'-Capping-Effizienz, darunter die Entwicklung von Oligonukleotid-Schienen (Sonden), RNase-H-Spaltung, IP-RP-Ionenpaar-Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (IP-RP-HPLC)/Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS) und Datenanalyse.
Regulatorische Anforderungen an die mRNA-Integrität
Gemäß den regulatorischen Erwägungen der WHO gilt „die Integrität der mRNA-Struktur als kritisches Qualitätsmerkmal für die Freigabe der mRNA. Daher ist eine Kontrolle der mRNA-Integrität, der 5'-Capping-Effizienz, des Vorhandenseins oder der Länge des 3'-Poly(A)-Schwanzes usw. erforderlich.“
Analytische Methode
Analyse |
Methoden |
mRNA 5'-Capping-Effizienz |
LC-MS nach Verdauung |
Verfahren
Schritt 1. Entwurf von Oligonukleotid-Schienen (Sonden)
Die Spaltsonde, die 2'-O-Methylnukleotide und Tetradesoxyribonukleotide enthält, dient dazu, einen komplementären RNA-Strang an spezifischen Positionen zu spalten, wenn RNase H vorhanden ist. Diese Methode erweist sich als äußerst wertvoll für die gezielte Erzeugung größerer RNA-Fragmente.
Schritt 2. RNase H-Spaltung
Eine biotinylierte Sonde, die strategisch so konzipiert ist, dass sie das 5'-Ende der mRNA ergänzt, wird in Verbindung mit RNase H eingesetzt, um die gezielte Spaltung des 5'-Endes des Oligonukleotids mit einer Cap-Struktur zu katalysieren.
Schritt 3. IP-RP-HPLC/LC-MS
Bei der LC-MS-Analyse von Oligonukleotiden wird die Ionenpaarung mit Umkehrphase (IP-RP) unter Verwendung von Amin-Zusätzen als mobile Phase bevorzugt. Dies ist auf ihre überlegene Auflösung und Kompatibilität mit der Massenspektrometrie (MS) zurückzuführen.
Schritt 4. Datenanalyse
Unterschiedliche Massen, die in Spaltfragmenten mit einer m7GpppG-Kappe beobachtet werden, im Gegensatz zu denen mit einer Diphosphat-, Triphosphat- oder unmethylierten G-Kappe (GpppG), erleichtern deren Identifizierung und ermöglichen die Abschätzung der Kappeneffizienz.
Fallbeispiel einer Capping-Effizienzanalyse mit LC-MS
Yaohai-Bio Pharma hat robuste Methoden zur Analyse der mRNA-Capping-Effizienz entwickelt, vom Design von Oligonukleotid-Schienen (Sonden), RNase H-Spaltung, IP-RP-HPLC/LC-MS bis hin zur Datenanalyse.
Die Gesamtionenchromatogramme (links) und Elektrospray-Massenspektren (rechts) von 5'-Endspaltfragmenten
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