mRNA 3' poly(A) karakterisering
mRNA 3' poly(A) karakterisering
3' poly(A) halen (polyadenosiner) af mRNA er integreret i post-transkriptionel regulering, hvilket påvirker mRNA eksport, stabilitet og translation. I tilfælde af in vitro-transskriberede (IVT) mRNA'er indføres poly(A)-halen enten under co-transskription på en template-måde eller gennem en enzymatisk tailing-proces på en ikke-templateret måde. Denne 3′ poly(A) tjener som en kritisk kvalitetsegenskab (CQA) for IVT RNA'er, hvilket nødvendiggør grundig karakterisering under både procesudvikling og batchfrigivelse.
Yaohai Bio-Pharma leverer specialiserede 3' poly(A) karakteriseringstjenester, der anvender teknikker såsom ribonuklease T1 (RNase T1) spaltning, ion-par omvendt fase højtydende væskekromatografi (IP-RP-HPLC)/væskekromatografi-massespektrometri (LC-MS), og omfattende dataanalyse.
Regulatoriske krav til mRNA 3' poly(A) karakterisering
Ifølge WHO's lovgivningsmæssige overvejelser anses integriteten af strukturen af mRNA'et for at være en kritisk kvalitetsegenskab for frigivelsen af mRNA'et. Der er således behov for kontrol for mRNA-integritet, 5′ capping effektivitet, 3′ poly(A) hale tilstedeværelse eller længde og så videre."
Analytisk metode
Analyse | Metoder |
mRNA 3' poly(A) karakterisering | LC-MS efter fordøjelse |
Procedure
Trin 1. RNase T1-spaltning
Direkte analyse af intakt mRNA i fuld længde ved LC-MS er upraktisk på grund af dets størrelse og heterogenitet. For at undersøge poly(A)-halen skal den spaltes fra mRNA'et i fuld længde. Den fremherskende metode involverer enzymatisk fordøjelse med RNase T1, selektiv spaltning af 3'-enden af rG, mens poly(A)-sekvensen bevares. mRNA-prøven gennemgår fordøjelse med RNase T1, og spaltningsfragmenter indeholdende poly(A)-strækninger isoleres ved anvendelse af oligo dT-coatede magnetiske perler.
Trin 2. IP-RP-HPLC/LC-MS
De ekstraherede haler gennemgik analyse ved hjælp af LC-MS, der tilbyder præcis halelængdeinformation ved enkeltnukleotidopløsning. I oligonukleotid LC-MS-analyse står ionparrende omvendt fase (IP-RP)-separationer med aminmobilfaseadditiver som den foretrukne kromatografiske tilstand på grund af deres robuste opløsningsevne og kompatibilitet med massespektrometri (MS).
Trin 3. Dataanalyse
Poly(A)-halelængden og dens relative overflod afhænger af antallet og intensiteten af toppe divideret med en masse adenosin. Ved bearbejdning eller afvikling af massespektret skelnes den forventede masse af en 100-mer poly(A) hale (33,163 Da i kasse) ledsaget af en række masser adskilt med 329 amu, svarende til massen af adenosin (A) .
Tilfælde af 3' poly(A) Karakterisering med LC–MS
Yaohai-BioPharma har udviklet en robust metode til mRNA 3' poly(A) karakterisering, herunder RNase T1 spaltning og IP-RP-HPLC/LC-MS.
Yaohai-BioPharma har udviklet en robust metode til mRNA 3' poly(A) karakterisering, herunder RNase T1 spaltning og IP-RP-HPLC/LC-MS.
EN
