mRNA 5'-afdækningseffektivitet
Betydningen af mRNA 5'capping effektivitetsanalyse
Cap-strukturen placeret ved 5'-enden af mRNA spiller en central rolle i den effektive translation, stabilisering og transport af mRNA'er i eukaryoter. I sammenhæng med in vitro-transskriberet (IVT) mRNA, introduceres 5'-hætten gennem enten co-transkriptionel capping eller enzymatiske capping-processer. Som en uundværlig komponent i IVT RNA'er står 5'-hætten som en kritisk kvalitetsegenskab (CQA), der nødvendiggør omfattende karakterisering gennem procesudvikling og batchfrigivelse.
Yaohai-Bio Pharma leverer omfattende 5'-dækningseffektivitetsanalyseløsninger, der omfatter oligonukleotidskinnedesign (probe), RNase H-spaltning, IP-RP-ion-par omvendt fase højtydende væskekromatografi (IP-RP-HPLC)/væskekromatografi -massespektrometri (LC-MS), dataanalyse.
Regulatoriske krav til mRNA-integritet
Ifølge WHO's lovgivningsmæssige overvejelser anses integriteten af strukturen af mRNA'et for at være en kritisk kvalitetsegenskab for frigivelsen af mRNA'et. Der er således behov for kontrol for mRNA-integritet, 5′ capping effektivitet, 3′ poly(A) hale tilstedeværelse eller længde og så videre."
Analytisk metode
Analyse |
Metoder |
mRNA 5'capping effektivitet |
LC-MS efter fordøjelse |
Procedure
Trin 1. Design af oligonukleotidskinne (probe).
Spaltningsproben, der inkorporerer 2'-O-methylnukleotider og tetradeoxyribonukleotider, tjener til at spalte en komplementær RNA-streng i specifikke positioner, når RNase H er til stede. Denne metode viser sig at være meget værdifuld til målrettet generering af større RNA-fragmenter.
Trin 2. RNase H-spaltning
En biotinyleret probe, strategisk designet til at være komplementær til 5'-enden af mRNA, påføres sammen med RNase H for at katalysere den målrettede spaltning af 5'-ende-oligonukleotidet, der har en cap-struktur.
Trin 3. IP-RP-HPLC/LC-MS
I oligonukleotid LC-MS-analyse er den foretrukne kromatografiske metode ionparrende omvendt fase (IP-RP)-separationer under anvendelse af amin-mobilfase-additiver. Dette tilskrives deres overlegne opløsningsevne og kompatibilitet med massespektrometri (MS).
Trin 4. Dataanalyse
Distinkte masser observeret i spaltningsfragmenter med en m7GpppG-hætte, i modsætning til dem med en diphosphat-, triphosphat- eller umethyleret G-cap (GpppG), letter deres identifikation og muliggør estimering af capping-effektivitet.
Et tilfælde af capping-effektivitetsanalyse med LC–MS
Yaohai-Bio Pharma har udviklet robuste metoder til mRNA-afdækningseffektivitetsanalyse, fra design af oligonukleotidskinne (probe), RNase H-spaltning, IP-RP-HPLC/LC-MS til dataanalyse.
De totale ion-kromatogrammer (venstre) og elektrospray-massespektre (højre) af 5'-endes spaltningsfragmenter
EN
