мРНА 3' поли(А) Карактеризација
мРНА 3' поли(А) Карактеризација
3' поли(А) реп (полиаденозини) мРНК је саставни део пост-транскрипционе регулације, утичући на извоз, стабилност и транслацију мРНК. У случају ин витро транскрибованих (ИВТ) мРНК, поли(А) реп се уводи или током ко-транскрипције на шаблонски начин или кроз ензимски процес задржавања репа на начин који није шаблонски. Овај 3′ поли(А) служи као критични атрибут квалитета (ЦКА) за ИВТ РНК, што захтева темељну карактеризацију како током развоја процеса тако и током пуштања серије.
Иаохаи Био-Пхарма пружа специјализоване услуге 3' поли(А) карактеризације, користећи технике као што је цепање рибонуклеазе Т1 (РНасе Т1), течна хроматографија високих перформанси са реверзном фазом са јонским паром (ИП-РП-ХПЛЦ)/течна хроматографија-масена спектрометрија (ЛЦ-МС) и свеобухватну анализу података.
Регулаторни захтеви за карактеризацију мРНА 3' поли(А).
Према регулаторним разматрањима СЗО, „интегритет структуре мРНК се сматра критичним атрибутом квалитета за ослобађање мРНК. Дакле, потребна је контрола за интегритет мРНА, ефикасност затварања 5′, присуство или дужину 3′ поли(А) репа и тако даље.
Аналитицал Метход
Анализа |
Методе |
мРНА 3' поли(А) карактеризација |
LЦ-МС након варења |
Поступак
Корак 1. Цепање РНазе Т1
Директна анализа интактне мРНК пуне дужине помоћу ЛЦ-МС је непрактична због њене величине и хетерогености. Да би се испитао поли(А) реп, он се мора одцепити од мРНК пуне дужине. Преовлађујућа метода укључује ензимску дигестију са РНазом Т1, селективно цепање 3′ краја рГ уз очување поли(А) секвенце. Узорак мРНК се подвргава варењу са РНазом Т1, а фрагменти цепања који садрже поли(А) деле се изолују коришћењем магнетних перли обложених олиго дТ.
Корак 2. ИП-РП-ХПЛЦ/ЛЦ-МС
Екстраховани репови су подвргнути анализи помоћу ЛЦ-МС, нудећи прецизне информације о дужини репа у резолуцији једног нуклеотида. У олигонуклеотидној ЛЦ-МС анализи, одвајања реверзне фазе (ИП-РП) упаривања јона са адитивима мобилне фазе амина представљају преферирани хроматографски начин, захваљујући њиховој снажној моћи раздвајања и компатибилности са масеном спектрометријом (МС).
Корак 3. Анализа података
Дужина репа поли(А) и његова релативна заступљеност зависе од броја и интензитета пикова подељених масом аденозина. Након обраде или деконволуције спектра масе, предвиђа се маса 100-мерног поли(А) репа (33,163 Да у кутији), праћена низом маса размакнутих за 329 аму, што је еквивалентно маси аденозина (А) .
Случај 3' поли(А) карактеризације са ЛЦ–МС
Иаохаи-БиоПхарма је развио робустан метод за карактеризацију мРНА 3' поли(А), укључујући цепање РНазе Т1 и ИП-РП-ХПЛЦ/ЛЦ-МС.
Иаохаи-БиоПхарма је развио робустан метод за карактеризацију мРНА 3' поли(А), укључујући цепање РНазе Т1 и ИП-РП-ХПЛЦ/ЛЦ-МС.
EN
