Ефикасност затварања мРНА 5'
Значај анализе ефикасности затварања мРНА 5'
Структура капе која се налази на 5′ крају мРНК игра кључну улогу у ефикасном превођењу, стабилизацији и транспорту мРНК унутар еукариота. У контексту ин витро транскрибоване (ИВТ) мРНК, 5' капа се уводи кроз ко-транскрипционо или ензимско затварање. Као незаменљива компонента ИВТ РНК, 5′ капа представља критични атрибут квалитета (ЦКА) који захтева свеобухватну карактеризацију током развоја процеса и пуштања серије.
Иаохаи-Био Пхарма пружа свеобухватна решења за анализу ефикасности затварања од 5', која обухватају дизајн олигонуклеотидних уложака (сонде), цепање РНазе Х, ИП-РП- јонски пар реверзно-фазне течне хроматографије високих перформанси (ИП-РП-ХПЛЦ)/течну хроматографију -масена спектрометрија (ЛЦ-МС), анализа података.
Регулаторни захтеви за интегритет мРНК
Према регулаторним разматрањима СЗО, „интегритет структуре мРНК се сматра критичним атрибутом квалитета за ослобађање мРНК. Дакле, потребна је контрола за интегритет мРНА, ефикасност затварања 5′, присуство или дужину 3′ поли(А) репа и тако даље.
Аналитицал Метход
Анализа |
Методе |
Ефикасност затварања мРНА 5' |
LЦ-МС након варења |
Поступак
Корак 1. Дизајн олигонуклеотидних удлага (сонде).
Сонда за цепање, која укључује 2'-О-метилнуклеотиде и тетрадеоксирибонуклеотиде, служи за цепање комплементарне РНК ланца на специфичним позицијама када је РНаза Х присутна. Овај метод се показао веома вредним за циљано стварање већих фрагмената РНК.
Корак 2. Цепање РНазе Х
Биотинилована сонда, стратешки дизајнирана да буде комплементарна 5' крају мРНК, примењује се заједно са РНазом Х да катализује циљано цепање олигонуклеотида 5' краја који поседује капасту структуру.
Корак 3. ИП-РП-ХПЛЦ/ЛЦ-МС
У олигонуклеотидној ЛЦ-МС анализи, пожељни хроматографски начин је раздвајање реверзне фазе (ИП-РП) упаривања јона коришћењем адитива мобилне фазе амина. Ово се приписује њиховој супериорној моћи разрешавања и компатибилности са масеном спектрометријом (МС).
Корак 4. Анализа података
Изразите масе уочене у фрагментима цепања са капом м7ГпппГ, за разлику од оних са дифосфатном, трифосфатном или неметилованом Г капом (ГпппГ), олакшавају њихову идентификацију и омогућавају процену ефикасности затварања.
Случај анализе ефикасности затварања помоћу ЛЦ–МС
Иаохаи-Био Пхарма је развила робусне методе за анализу ефикасности затварања мРНА, од дизајна олигонуклеотидних уложака (сонде), цепања РНазе Х, ИП-РП-ХПЛЦ/ЛЦ-МС до анализе података.
Укупни јонски хроматограми (лево) и масени спектри електроспреј (десно) фрагмената цепања 5'-краја
EN
