Przygotowanie mRNA IVT

Transkrypcja in vitro (IVT) jest preferowaną metodą przygotowywania mRNA, zdolną do uzyskania mikrogramów do miligramów mRNA w skali laboratoryjnej. Do celów badawczych dostawcy odczynników opracowali wszechstronne systemy reakcji IVT odpowiednie dla mRNA o średniej długości (1000–4000 nukleotydów).

W tym artykule podsumowujemy transkrypcję in vitro (IVT) mRNA, w tym konwencjonalny układ reakcji IVT stosowany w skali laboratoryjnej oraz układ reakcji IVT odpowiedni dla ultradługiego mRNA (>9000 nukleotydów).

Zestawy umożliwiają kotranskrypcyjne zamykanie z CleanCap AG i zmniejszają immunogenność z m1ψ. DNaza I usuwa resztkowe DNA. Niska wydajność może być spowodowana słabym mieszaniem, utlenianiem odczynników lub problemami z matrycą DNA, które można złagodzić przez wirowanie, świeże odczynniki, kontrole i dostosowanie ilości matrycy/czasu reakcji.

Yaohai Bio-Pharma dostarcza różnorodne prefabrykowane produkty IVT RNA (płyn/liofilizowany proszek) oraz gotowe produkty LNP, kodujące białka, takie jak białka fluorescencyjne (eGFP, mCHERRY), lucyferazę, rekombinazę Cre i antygen OVA, aby sprostać różnym potrzebom eksperymentalnym lub projektowym.

System IVT do ultradługiego mRNA

Konwencjonalna IVT może nie działać w przypadku zbyt długiego mRNA (>9000 nt). Potrzebne jest głębokie zrozumienie i racjonalne dostosowanie składników IVT.

Szablon DNA: Zlinearyzowane plazmidy lub produkty PCR z odpowiadającymi sekwencjami promotora, rozpuszczone w H2O wolnym od RNazy. Zalecane jest stężenie matrycy DNA wyższe niż 40 nM dla optymalnych warunków IVT.

NTC: Utrzymuje aktywność enzymu podczas transkrypcji. Świeży DTT należy dodać do buforu reakcyjnego w celu uzyskania optymalnej aktywności enzymu.

Inhibitor rybonukleazy: Hamuje aktywność rybonukleazy i utrzymuje stabilność mRNA.

Polimeraza RNA T7: Katalizuje transkrypcję DNA do RNA, odpowiadającą sekwencji promotora. Aktywność polimerazy RNA T7 jest zależna od pH i jonów magnezu.

Jony magnezu (Mg2+): Kofaktor dla polimerazy RNA. Zbyt niskie stężenia zmniejszają wydajność transkrypcji, podczas gdy zbyt wysokie stężenia prowadzą do degradacji RNA. Wolny [Mg2+] powinien być dostosowany na podstawie stężenia nukleotydów. Każdy nukleotyd chelatuje jeden [Mg2+], więc stężenie [Mg2+] powinno przekraczać całkowite stężenie nukleotydów.

Trifosforany nukleozydów (NTP): Jako substraty NTP są podstawowymi jednostkami RNA. Stężenia NTP powyżej 7 mM mają pozytywny wpływ na produkcję mRNA.

Spermidyna: Stabilizuje kompleksy DNA-enzym i stymuluje reakcje transkrypcyjne; jednak nadmierne stężenia mają działanie hamujące. Zalecane stężenie spermidyny wynosi od 1 do 3 mM.

Nieorganiczna pirofosfataza (PPaza): Dodawany do reakcji IVT w celu zapobiegania gromadzeniu się nieorganicznych jonów pirofosforanowych (PPi), zapobiegania ich chelatowaniu z Mg2+ i zapewnienia wystarczającej ilości wolnego Mg2+.

Wykorzystując pionierską technologię i doświadczenie w zakresie IVT mRNA, Yaohai Bio-Pharma zapewnia kompleksową usługę IVT RNA, obejmującą projektowanie sekwencji, przygotowanie IVT RNA (z modyfikacjami m1ψ), cyklizację RNA, oczyszczanie, liofilizację, enkapsulację LNP i testy jakości.

Aktywnie poszukujemy także partnerów instytucjonalnych lub indywidualnych na całym świecie. Oferujemy najbardziej konkurencyjne wynagrodzenie w branży. Jeśli masz jakiekolwiek pytania, skontaktuj się z nami: [email protected]