Przygotowanie mRNA IVT

Transkrypcja in vitro (IVT) jest preferowaną metodą przygotowywania mRNA, zdolną do uzyskania mikrogramów do miligramów mRNA w skali laboratoryjnej. W celach badawczych dostawcy reagentów opracowali uniwersalne systemy reakcji IVT odpowiednie dla mRNA o umiarkowanej długości (1000-4000 nukleotydów).

W niniejszym artykule podsumujemy transkrypcję in vitro (IVT) mRNA, w tym tradycyjny system reakcji IVT stosowany w skali laboratoryjnej oraz system reakcji IVT odpowiedni dla ultra-długiego mRNA (>9000 nukleotydów).

Komplety umożliwiają współtranskrypcyjne kaptowanie za pomocą CleanCap AG i zmniejszają immunogeniczność za pomocą m1ψ. DNaza I usuwa resztkowe DNA. Niska wydajność może być spowodowana niepełnym wymieszaniem, utlenieniem reagentów lub problemami z szablonem DNA, które można ograniczyć poprzez centrifugację, свieże reagensty, kontrolę oraz dostosowanie ilości szablonu/czasu reakcji.

Yaohai Bio-Pharma oferuje różne wstępnie przygotowane produkty IVT RNA (caidło/ proszek suszony) oraz gotowe produkty LNP, kodujące białka takie jak białka fluorescencyjne (eGFP, mCHERRY), luceferaza, rekombinaza Cre i antigen OVA, aby spełnić różnorodne potrzeby doświadczalne lub projektowe.

System IVT dla ultradługiego mRNA

Klasyczny IVT może nie działać dla nadmiernie długiego mRNA (>9000 nt). Wymagane są głębokie zrozumienie i racjonalne dostosowanie składników IVT.

Szablon DNA: Plazmidy liniowe lub produkty PCR z odpowiednimi sekwencjami promotorów, rozpuszczone w wodzie bez RNase. Zalecana jest koncentracja szablonu DNA wyższa niż 40 nM dla optymalnych warunków IVT.

DTT: Utrzymuje aktywność enzymów podczas transkrypcji. Do optymalnej aktywności enzymów należy dodać свieży DTT do bufora reakcyjnego.

Inhibitor RNase: Inhibuje aktywność RNase i utrzymuje stabilność mRNA.

Polimeraza RNA T7: Katalizuje transkrypcję DNA w RNA, odpowiadającą sekwencji promotorowej. Aktywność polimerazy RNA T7 jest wpływowana przez pH i jonów magnezu.

Jony Magnezu (Mg2+): Kofaktor dla polimerazy RNA. Zbyt niskie stężenia obniżają wydajność transkrypcji, podczas gdy zbyt wysokie stężenia prowadzą do degradacji RNA. Wolny [Mg2+] powinien być dostosowany na podstawie stężenia nukleotydów. Każdy nukleotyd wiąże jeden [Mg2+], dlatego stężenie [Mg2+] powinno przekraczać łączne stężenie nukleotydów.

Nukleozydy Tryfosforanowe (NTP): Jako substraty, NTP są podstawowymi jednostkami RNA. Stężenia NTP powyżej 7 mM mają pozytywny wpływ na produkcję mRNA.

Spermidyna: Stabilizuje kompleksy DNA-enzymu i pobudza reakcje transkrypcji; jednak zbyt wysokie stężenia mogą mieć efekty hamujące. Zalecane stężenie spermidyny wynosi od 1 do 3 mM.

Pirofosfataza Inorganiczna (PPase): Dodano do reakcji IVT, aby zapobiec akumulacji jonów inorganicznego pirofosforanu (PPi), unikając ich chelacji z Mg2+ i zapewniając wystarczające ilości wolnego Mg2+.

Korzystając z pionierskiej technologii i doświadczenia w zakresie mRNA IVT, Yaohai Bio-Pharma oferuje kompleksową usługę IVT RNA, obejmującą projektowanie sekwencji, przygotowanie RNA IVT (z modyfikacjami m1ψ), cyklicyzację RNA, oczyszczanie, sušczenie, enkapsulację LNP oraz testy jakościowe.

Szukamy również globalnych partnerów instytucjonalnych lub indywidualnych. Ofiarowujemy najbardziej konkurencyjne wynagrodzenie w branży. Jeśli masz jakiekolwiek pytania, prosimy o kontakt: [email protected]