Op vloeistofchromatografie-massaspectrometrie (LC-MS) gebaseerde peptidekarteringsgegevens zullen een grote hoeveelheid informatie verschaffen over de primaire en hogere orde structuur van natieve en recombinante eiwitten, inclusief dekking van aminozuursequenties, post-translationele modificaties (PTM's, bijv. glycosylatie , oxidatie, deamidering), disulfidebindingen, enz.
Yaohai Bio-Pharma biedt analysediensten voor het in kaart brengen van peptiden voor uw doeleiwit via LC-MS, om uw onderzoek naar de eiwitstructuur te versnellen.
We zijn betrokken geweest bij de eiwitstructurele karakterisering van verschillende grote moleculen, waaronder recombinante subeenheidvaccins, nanobodies/VHHs/single-domein antilichamen (sdAbs), antilichaamfragmenten, hormonen/peptiden, cytokinen, groeifactoren (GF), enzymen, collagenen, enz.
Regelgevende vereisten voor het in kaart brengen van peptiden
De ICHQ6B-richtlijn beveelt aan: “Selectieve fragmentatie van het product in afzonderlijke peptiden wordt uitgevoerd met behulp van geschikte enzymen of chemicaliën en de resulterende peptidefragmenten worden geanalyseerd met HPLC of een andere geschikte analytische procedure. Peptidefragmenten moeten zoveel mogelijk worden geïdentificeerd met behulp van technieken zoals analyse van de aminozuursamenstelling, N-terminale sequencing of massaspectrometrie (MS). Peptide mapping van de werkzame stof of het geneesmiddelproduct (DP) met behulp van een op de juiste manier gevalideerde methode is een methode die vaak wordt gebruikt om de gewenste productstructuur voor batchvrijgave te bevestigen.”
Analytische methodes
| Analyse |
Methoden |
| Peptide-mapping |
Proteasevertering en vloeistofchromatografie-massaspectrometrie (LC-MS) |
Analytische procedure
1. Reductie en alkylering
Het doel is om disulfidebruggen te verminderen en de gegenereerde vrije thiol te blokkeren. Reductie van disulfidebruggen helpt de eiwitstructuur te openen, waardoor de proteolytische vertering efficiënter wordt. Deze stap zal ook de bruggen tussen de ketens breken in het geval van eiwitten met meerdere ketens die disulfidebruggen hebben die de ketens verbinden (bijvoorbeeld monoklonale antilichamen, mAbs).
2. Vertering van het eiwit met behulp van enzymen
Het doel is om het eiwit af te breken tot peptiden. We kozen de enzymen op basis van de theoretische sequentie van het eiwit en de kennis van de theoretische vertering van het eiwit door enzymen. Door op deze manier enzymen te kiezen, zou dit moeten resulteren in de beste analyse van het in kaart brengen van peptiden.
3. Analyse van de verteerde peptiden Met behulp van online omgekeerde fase-hogeprestatievloeistofchromatografie met ultraviolet (UV) en elektrospray-massaspectrometrische detectie (LC/ES-MS).
Peptidescheiding op basis van polariteit met behulp van LC (reverse phase-LC)
Terwijl het peptide uit de LC-kolom elueert, genereert de massaspectrometer massa-informatie samen met fragmentioninformatie, waardoor we de sequentie-informatie kunnen bepalen. We gebruiken de sequentie-informatie om de identiteit van het peptide te bevestigen en primaire informatie te verstrekken.
We kunnen ook de fragmentatie-informatie van de peptiden genereren wanneer ze vanuit de LC-kolom de bron van de massaspectrometer binnenkomen. Afhankelijk van de eisen van het onderzoek is dit selectieve LC-MS/MS of niet-selectieve LC-MS/MS, wat kan worden beschouwd als een vorm van tandem-MS.
EN
AR
HR
CS
DA
NL
FI
FR
DE
EL
IT
JA
KO
NEE
PL
PT
RO
RU
ES
SV
IW
ID
LV
LT
SR
SK
SL
UK
VI
ET
HU
TH
TR
FA
AF
MS
BE
MK
UR
BN
