mRNA 3' poli(A) Pencirian
mRNA 3' poli(A) Pencirian
Ekor 3' poli(A) (poliadenosin) mRNA adalah penting kepada peraturan pasca transkrip, mempengaruhi eksport, kestabilan dan terjemahan mRNA. Dalam kes mRNA transkripsi in vitro (IVT), ekor poli(A) diperkenalkan sama ada semasa transkripsi bersama dalam cara templat atau melalui proses tailing enzimatik dalam cara yang tidak templat. Poli(A) 3' ini berfungsi sebagai atribut kualiti kritikal (CQA) untuk RNA IVT, yang memerlukan pencirian menyeluruh semasa pembangunan proses dan pelepasan kelompok.
Yaohai Bio-Pharma menyediakan perkhidmatan pencirian poli(A) 3' khusus, menggunakan teknik seperti belahan ribonuklease T1 (RNase T1), kromatografi cecair prestasi tinggi fasa terbalik pasangan ion (IP-RP-HPLC)/kromatografi cecair-spektrometri jisim (LC-MS), dan analisis data yang komprehensif.
Keperluan Kawal Selia untuk Pencirian mRNA 3' poly(A).
Menurut pertimbangan kawal selia WHO, “integriti struktur mRNA dianggap sebagai atribut kualiti kritikal untuk pembebasan mRNA. Oleh itu, kawalan diperlukan untuk integriti mRNA, kecekapan penutupan 5′, kehadiran atau panjang ekor poli(A) 3′ dan sebagainya.”
Kaedah Analisis
Analisis |
Kaedah |
pencirian mRNA 3' poli(A). |
LC-MS selepas penghadaman |
Prosedur
Langkah 1. belahan RNase T1
Analisis langsung mRNA utuh penuh oleh LC-MS adalah tidak praktikal kerana saiz dan heterogenitinya. Untuk memeriksa ekor poli(A), ia mesti dibelah daripada mRNA penuh. Kaedah lazim melibatkan pencernaan enzimatik dengan RNase T1, secara selektif membelah hujung 3′ rG sambil mengekalkan jujukan poli(A). Sampel mRNA menjalani pencernaan dengan RNase T1, dan serpihan belahan yang mengandungi regangan poli(A) diasingkan menggunakan manik magnet bersalut oligo dT.
Langkah 2. IP-RP-HPLC/LC-MS
Ekor yang diekstrak menjalani analisis menggunakan LC-MS, menawarkan maklumat panjang ekor yang tepat pada resolusi nukleotida tunggal. Dalam analisis LC-MS oligonukleotida, pemisahan fasa terbalik (IP-RP) pasangan ion dengan aditif fasa mudah alih amina kekal sebagai mod kromatografi pilihan, kerana kuasa penyelesaian yang mantap dan keserasian dengan spektrometri jisim (MS).
Langkah 3. Analisis data
Panjang ekor poli(A) dan kelimpahan relatifnya bergantung pada bilangan dan keamatan puncak dibahagikan dengan jisim adenosin. Apabila memproses atau menyahbelitkan spektrum jisim, jangkaan jisim bagi 100-mer poli(A) ekor (33,163 Da dalam kotak) dilihat, disertai dengan satu siri jisim yang dijarakkan dengan 329 amu, bersamaan dengan jisim adenosin (A) .
Kes 3' poli(A) Pencirian dengan LC–MS
Yaohai-BioPharma telah membangunkan kaedah yang teguh untuk pencirian mRNA 3' poli(A), termasuk belahan RNase T1 dan IP-RP-HPLC/LC-MS.
Yaohai-BioPharma telah membangunkan kaedah yang teguh untuk pencirian mRNA 3' poli(A), termasuk belahan RNase T1 dan IP-RP-HPLC/LC-MS.
EN
