mRNA 5'capping Kecekapan
Kepentingan Analisis Kecekapan mRNA 5'capping
Struktur penutup yang terletak di hujung 5' mRNA memainkan peranan penting dalam terjemahan yang cekap, penstabilan, dan pengangkutan mRNA dalam eukariota. Dalam konteks mRNA yang ditranskripsikan secara in vitro (IVT), penutup 5' diperkenalkan sama ada melalui proses penutupan transkrip bersama atau penutupan enzimatik. Sebagai komponen penting bagi RNA IVT, penutup 5′ berdiri sebagai atribut kualiti kritikal (CQA) yang memerlukan pencirian menyeluruh sepanjang pembangunan proses dan pelepasan kelompok.
Yaohai-Bio Pharma menyediakan penyelesaian analisis kecekapan capping 5' yang komprehensif, merangkumi reka bentuk splin (probe) oligonukleotida, belahan RNase H, IP-RP- pasangan Ion fasa terbalik kromatografi cecair prestasi tinggi (IP-RP-HPLC)/kromatografi cecair -spektrometri jisim (LC-MS), analisis data.
Keperluan Kawal Selia untuk integriti mRNA
Menurut pertimbangan kawal selia WHO, “integriti struktur mRNA dianggap sebagai atribut kualiti kritikal untuk pembebasan mRNA. Oleh itu, kawalan diperlukan untuk integriti mRNA, kecekapan penutupan 5′, kehadiran atau panjang ekor poli(A) 3′ dan sebagainya.”
Kaedah Analisis
Analisis | Kaedah |
mRNA 5'capping Kecekapan | LC-MS selepas penghadaman |
Prosedur
Langkah 1. Reka bentuk splin (probe) oligonukleotida
Siasatan belahan, yang menggabungkan 2'-O-methylnucleotides dan tetradeoxyribonucleotides, berfungsi untuk membelah untaian RNA pelengkap pada kedudukan tertentu apabila RNase H hadir. Kaedah ini terbukti sangat berharga untuk penjanaan sasaran serpihan RNA yang lebih besar.
Langkah 2. belahan RNase H
Siasatan terbiotinilasi, direka secara strategik untuk menjadi pelengkap kepada hujung 5' mRNA, digunakan bersama-sama dengan RNase H untuk memangkinkan pembelahan yang disasarkan bagi oligonukleotida hujung 5' yang mempunyai struktur penutup.
Langkah 3. IP-RP-HPLC/LC-MS
Dalam analisis LC-MS oligonukleotida, mod kromatografi pilihan ialah pemisahan fasa terbalik (IP-RP) pasangan ion menggunakan bahan tambahan fasa mudah alih amina. Ini disebabkan oleh kuasa penyelesaian yang unggul dan keserasian dengan spektrometri jisim (MS).
Langkah4. Analisis data
Jisim berbeza yang diperhatikan dalam serpihan belahan yang menampilkan penutup m7GpppG, berbeza dengan yang mempunyai penutup difosfat, trifosfat atau G yang tidak dimetilasi (GpppG), memudahkan pengecamannya dan membolehkan anggaran kecekapan pengehadan.
Kes analisis kecekapan pengehadan dengan LC–MS
Yaohai-Bio Pharma telah membangunkan kaedah yang teguh untuk analisis kecekapan penutupan mRNA, daripada reka bentuk serpihan (probe) oligonukleotida, belahan RNase H, IP-RP-HPLC/LC-MS kepada analisis data.
Jumlah kromatogram ion (kiri) dan spektrum jisim semburan elektrik (kanan) serpihan belahan hujung 5'
EN
