Efficienza del capping dell'mRNA

Il significato dell'analisi dell'efficienza del capping dell'mRNA 5'

La struttura del cappuccio situata all'estremità 5 'dell'mRNA svolge un ruolo fondamentale nell'efficiente traduzione, stabilizzazione e trasporto degli mRNA all'interno degli eucarioti. Nel contesto dell'mRNA trascritto in vitro (IVT), il cappuccio 5' viene introdotto attraverso processi di capping co-trascrizionale o di capping enzimatico. Essendo un componente indispensabile degli RNA IVT, il cappuccio da 5′ rappresenta un attributo critico di qualità (CQA) che richiede una caratterizzazione completa durante lo sviluppo del processo e il rilascio del lotto.

Yaohai-Bio Pharma fornisce soluzioni complete per l'analisi dell'efficienza della tappatura da 5', che comprendono la progettazione di splint oligonucleotidici (sonda), la scissione dell'RNasi H, la cromatografia liquida ad alte prestazioni a fase inversa IP-RP-coppia ionica (IP-RP-HPLC)/cromatografia liquida -spettrometria di massa (LC-MS), analisi dei dati.

Requisiti normativi per l'integrità dell'mRNA

Secondo le considerazioni normative dell'OMS, “l'integrità della struttura dell'mRNA è considerata un attributo di qualità critico per il rilascio dell'mRNA. Pertanto, è necessario il controllo dell’integrità dell’mRNA, dell’efficienza del capping 5′, della presenza o della lunghezza della coda poli(A) 3′ e così via.

Metodo analitico

Procedura

Passaggio 1. Progettazione di splint oligonucleotidici (sonda).

La sonda di scissione, che incorpora 2'-O-metilnucleotidi e tetradeossiribonucleotidi, serve a scindere un filamento di RNA complementare in posizioni specifiche quando è presente RNasi H. Questo metodo si rivela estremamente prezioso per la generazione mirata di frammenti di RNA più grandi.

Passaggio 2. Scissione della RNasi H

Una sonda biotinilata, progettata strategicamente per essere complementare all'estremità 5' dell'mRNA, viene applicata insieme all'RNasi H per catalizzare la scissione mirata dell'oligonucleotide all'estremità 5' che possiede una struttura a cappuccio.

Passaggio 3. IP-RP-HPLC/LC-MS

Nell'analisi LC-MS degli oligonucleotidi, la modalità cromatografica preferita è la separazione in fase inversa con accoppiamento ionico (IP-RP) che utilizza additivi della fase mobile amminica. Ciò è attribuito al loro potere risolutivo superiore e alla compatibilità con la spettrometria di massa (MS).

Passaggio 4. Analisi dei dati

Masse distinte osservate nei frammenti di scissione caratterizzati da un cappuccio m7GpppG, in contrasto con quelli con un cappuccio G difosfato, trifosfato o non metilato (GpppG), facilitano la loro identificazione e consentono la stima dell'efficienza di capping.

Caso di analisi dell'efficienza del capping con LC-MS

Yaohai-Bio Pharma ha sviluppato metodi efficaci per l'analisi dell'efficienza del capping dell'mRNA, dalla progettazione di splint oligonucleotidici (sonda), al clivaggio di RNasi H, IP-RP-HPLC/LC-MS all'analisi dei dati.

I cromatogrammi ionici totali (a sinistra) e gli spettri di massa elettrospray (a destra) dei frammenti di scissione dell'estremità 5'