Préparation de l'ARNm IVT

La transcription in vitro (IVT) est la méthode privilégiée pour la préparation d'ARNm, capable de produire des microgrammes à des milligrammes d'ARNm à l'échelle du laboratoire. À des fins de recherche, les fournisseurs de réactifs ont développé des systèmes de réaction IVT polyvalents adaptés à l'ARNm de longueur moyenne (1000 4000 à XNUMX XNUMX nucléotides).

Dans cet article, nous résumerons la transcription in vitro (IVT) de l'ARNm, y compris le système de réaction IVT conventionnel utilisé à l'échelle du laboratoire et le système de réaction IVT adapté à l'ARNm ultra-long (> 9000 XNUMX nucléotides).

Les kits permettent le co-coiffage transcriptionnel avec CleanCap AG et réduisent l'immunogénicité avec m1ψ. La DNase I élimine l'ADN résiduel. Un faible rendement peut être dû à un mauvais mélange, à l'oxydation des réactifs ou à des problèmes de matrice d'ADN, qui peuvent être atténués par la centrifugation, des réactifs frais, des contrôles et l'ajustement de la quantité de matrice/du temps de réaction.

Yaohai Bio-Pharma fournit divers produits d'ARN IVT préfabriqués (poudre liquide/lyophilisée) et produits finis LNP, codant pour des protéines telles que les protéines fluorescentes (eGFP, mCHERRY), la luciférase, la recombinase Cre et l'antigène OVA, pour répondre à différents besoins expérimentaux ou de projet.

Système IVT pour ARNm ultra-long

L'IVT conventionnelle peut ne pas fonctionner pour les ARNm trop longs (> 9000 nt). Une compréhension approfondie et un ajustement rationnel des composants de l'IVT sont nécessaires.

Modèle d'ADN : Plasmides linéarisés ou produits PCR avec séquences promotrices correspondantes, dissous dans de l'eau sans RNase. Une concentration de matrice d'ADN supérieure à 2 nM est recommandée pour des conditions IVT optimales.

TNT : Maintient l'activité enzymatique pendant la transcription. Du DTT frais doit être ajouté au tampon de réaction pour une activité enzymatique optimale.

Inhibiteur de RNase : Inhibe l’activité RNase et maintient la stabilité de l’ARNm.

ARN polymérase T7 : Catalyse la transcription de l'ADN en ARN, correspondant à la séquence promotrice. L'activité de l'ARN polymérase T7 est affectée par le pH et les ions magnésium.

Ions magnésium (Mg2+) : Cofacteur de l'ARN polymérase. Des concentrations trop faibles réduisent l'efficacité de la transcription, tandis que des concentrations trop élevées entraînent une dégradation de l'ARN. Le [Mg2+] libre doit être ajusté en fonction de la concentration en nucléotides. Chaque nucléotide chélate un [Mg2+], de sorte que la concentration en [Mg2+] doit dépasser la concentration totale en nucléotides.

Nucléoside triphosphates (NTP) : En tant que substrats, les NTP sont les unités de base de l'ARN. Des concentrations de NTP supérieures à 7 mM ont un impact positif sur la production d'ARNm.

Spermidine : Stabilise les complexes ADN-enzyme et stimule les réactions de transcription ; cependant, des concentrations excessives ont des effets inhibiteurs. La concentration de spermidine recommandée est comprise entre 1 et 3 mM.

Pyrophosphatase inorganique (PPase) : Ajouté aux réactions IVT pour empêcher l'accumulation d'ions pyrophosphate inorganiques (PPi), évitant leur chélation avec Mg2+ et garantissant une quantité suffisante de Mg2+ libre.

S'appuyant sur une technologie pionnière et sur l'expérience de l'ARNm IVT, Yaohai Bio-Pharma fournit un service d'ARN IVT à guichet unique, englobant la conception de séquences, la préparation d'ARN IVT (avec des mods m1ψ), la cyclisation de l'ARN, la purification, la lyophilisation, l'encapsulation LNP et les tests de qualité.

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