Préparation de l'ARNm IVT

La transcription in vitro (IVT) est la méthode privilégiée pour préparer de l'ARNm, capable de produire des microgrammes à des milligrammes d'ARNm à une échelle de laboratoire. À des fins de recherche, les fournisseurs de réactifs ont développé des systèmes de réaction IVT polyvalents adaptés à l'ARNm de longueur modérée (1000-4000 nucléotides).

Dans cet article, nous résumerons la transcription in vitro (IVT) de l'ARNm, y compris le système de réaction IVT conventionnel utilisé à une échelle de laboratoire et le système de réaction IVT adapté à l'ARNm ultra-long (>9000 nucléotides).

Les kits permettent un cappage co-transcriptionnel avec CleanCap AG et réduisent l'immunogénicité avec m1ψ. La DNase I élimine l'ADN résiduel. Un rendement faible peut être dû à un mélange insuffisant, à l'oxydation des réactifs ou à des problèmes liés au modèle d'ADN, qui peuvent être atténués par centrifugation, des réactifs frais, des contrôles et l'ajustement de la quantité de modèle/temps de réaction.

Yaohai Bio-Pharma propose divers produits d'ARN IVT préfabriqués (liquide/poudre lyophilisée) et des produits finis LNP, codant pour des protéines telles que des protéines fluorescentes (eGFP, mCHERRY), la luciférase, la recombinase Cre et l'antigène OVA, afin de répondre à différents besoins expérimentaux ou de projet.

Système IVT pour ARNm ultra-long

L'IVT conventionnel peut ne pas fonctionner pour des ARNm trop longs (>9000 nt). Une compréhension approfondie et un ajustement rationnel des composants IVT sont nécessaires.

Modèle ADN : Plasmides linéarisés ou produits PCR avec les séquences de promoteur correspondantes, dissous dans de l'H2O sans RNase. Il est recommandé d'utiliser une concentration de modèle ADN supérieure à 40 nM pour des conditions IVT optimales.

DTT : Maintient l'activité enzymatique pendant la transcription. Un DTT frais doit être ajouté au tampon de réaction pour une activité enzymatique optimale.

Inhibiteur de RNase : Inhibe l'activité de la RNase et maintient la stabilité de l'ARNm.

Polymérase ARN T7 : Catalyse la transcription de l'ADN en ARN, correspondant à la séquence du promoteur. L'activité de la polymérase d'ARN T7 est influencée par le pH et les ions magnésium.

Ions Magnésium (Mg2+): Un cofacteur pour la polymérase d'ARN. Des concentrations trop faibles réduisent l'efficacité de la transcription, tandis que des concentrations trop élevées entraînent la dégradation de l'ARN. Le [Mg2+] libre doit être ajusté en fonction de la concentration en nucléotides. Chaque nucléotide chélate un [Mg2+], donc la concentration de [Mg2+] doit dépasser la concentration totale des nucléotides.

Triphosphates de Nucléosides (NTP): En tant que substrats, les NTP sont les unités de base de l'ARN. Les concentrations de NTP supérieures à 7 mM ont un impact positif sur la production d'ARNm.

Spermidine: Stabilise les complexes ADN-enzyme et stimule les réactions de transcription ; cependant, des concentrations excessives ont des effets inhibiteurs. La concentration recommandée de spermidine est comprise entre 1 et 3 mM.

Pyrophosphatase Inorganique (PPase): Ajouté aux réactions IVT pour empêcher l'accumulation d'ions pyrophosphate inorganique (PPi), évitant leur chélation avec Mg2+ et garantissant une quantité suffisante de Mg2+ libre.

En s'appuyant sur une technologie pionnière et une expérience en IVT mRNA, Yaohai Bio-Pharma propose un service complet de RNA IVT, comprenant la conception de séquences, la préparation de RNA IVT (avec mods m1ψ), la cyclisation du RNA, la purification, la lyophilisation, l'encapsulation LNP et les tests de qualité.

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