IVT mRNA valmistamine

In vitro transkriptsioon (IVT) on eelistatud meetod mRNA valmistamiseks, mis on võimeline laboratoorses skaalal tootma mikrogramme kuni milligrammi mRNA-d. Uurimise eesmärgil on reaktiivide tarnijad välja töötanud mitmekülgsed IVT reaktsioonisüsteemid, mis sobivad mõõduka pikkusega (1000–4000 nukleotiidi) mRNA jaoks.

Selles artiklis teeme kokkuvõtte mRNA in vitro transkriptsioonist (IVT), sealhulgas tavapärasest laboris kasutatavast IVT reaktsioonisüsteemist ja ülipika mRNA jaoks (>9000 nukleotiidi) sobiva IVT reaktsioonisüsteemi.

Komplektid võimaldavad kaastranskriptsiooni piiramist CleanCap AG-ga ja vähendavad immunogeensust m1ψ abil. DNaas I eemaldab jääk-DNA. Madal saagis võib olla tingitud halvast segamisest, reaktiivi oksüdatsioonist või DNA matriitsi probleemidest, mida saab leevendada tsentrifuugimise, värskete reaktiivide, kontrollide ja matriitsi koguse/reaktsiooniaja reguleerimisega.

Yaohai Bio-Pharma pakub erinevaid kokkupandavaid IVT RNA tooteid (vedel/külmkuivatatud pulber) ja LNP valmistooteid, mis kodeerivad selliseid valke nagu fluorestseeruvad valgud (eGFP, mCHERRY), lutsiferaas, rekombinaas Cre ja antigeen OVA, et täita erinevaid katseid või projekte. vajadustele.

IVT süsteem ülipika mRNA jaoks

Tavaline IVT ei pruugi liiga pika mRNA puhul (>9000 nt) töötada. Vaja on IVT komponentide sügavat mõistmist ja ratsionaalset kohandamist.

DNA mall: Lineariseeritud plasmiidid või PCR produktid vastavate promootorjärjestustega, lahustatud RNaasi-vabas H2O-s. Optimaalsete IVT tingimuste jaoks on soovitatav DNA matriitsi kontsentratsioon üle 40 nM.

DTT: Säilitab ensüümi aktiivsuse transkriptsiooni ajal. Optimaalse ensüümi aktiivsuse tagamiseks tuleks reaktsioonipuhvrisse lisada värsket DTT-d.

RNaasi inhibiitor: Inhibeerib RNaasi aktiivsust ja säilitab mRNA stabiilsuse.

T7 RNA polümeraas: Katalüüsib DNA transkriptsiooni RNA-ks, mis vastab promootorjärjestusele. T7 RNA polümeraasi aktiivsust mõjutavad pH ja magneesiumiioonid.

Magneesiumioonid (Mg2+): RNA polümeraasi kofaktor. Liiga madalad kontsentratsioonid vähendavad transkriptsiooni efektiivsust, samas kui liiga kõrged kontsentratsioonid põhjustavad RNA lagunemist. Vaba [Mg2+] tuleb reguleerida nukleotiidide kontsentratsiooni alusel. Iga nukleotiid moodustab ühe [Mg2+] kelaadi, seega peaks [Mg2+] kontsentratsioon ületama nukleotiidide kogukontsentratsiooni.

Nukleosiidtrifosfaadid (NTP): Substraatidena on NTP-d RNA põhiühikud. NTP kontsentratsioonid üle 7 mM avaldavad positiivset mõju mRNA tootmisele.

Spermidiin: Stabiliseerib DNA-ensüümi komplekse ja stimuleerib transkriptsioonireaktsioone; ülemäärastel kontsentratsioonidel on aga pärssiv toime. Soovitatav spermidiini kontsentratsioon on vahemikus 1 kuni 3 mM.

Anorgaaniline pürofosfataas (PPaas): Lisatud IVT reaktsioonidele, et vältida anorgaaniliste pürofosfaadiioonide (PPi) kuhjumist, vältides nende kelaatimist Mg2+-ga ja tagades piisava vaba Mg2+ moodustumise.

Kasutades teedrajavat tehnoloogiat ja IVT mRNA kogemust, pakub Yaohai Bio-Pharma ühtset IVT RNA teenust, mis hõlmab järjestuste kujundamist, IVT RNA ettevalmistamist (koos m1ψ modifikatsioonidega), RNA tsükliseerimist, puhastamist, külmkuivatamist, LNP kapseldamist ja kvaliteeditesti.

Otsime aktiivselt ka institutsionaalseid või individuaalseid globaalseid partnereid. Pakume valdkonna kõige konkurentsivõimelisemat tasu. Kui teil on küsimusi, võtke meiega julgelt ühendust: [email protected]