IVT mRNA ettevalmistamine

In vitro transkriptsioon (IVT) on eelistatud meetod mRNA valmistamiseks, mis võib toota laboritooriumimastikul mikrogramme kuni milligrammide suurusega mRNA. Uurimistööde jaoks on reageentide tarnijad arendanud mitmekeseseid IVT reaktsioonisüsteeme, mis sobivad keskmise pikkusega (1000-4000 nukleotiidi) mRNA jaoks.

Selles artiklis kokkuvõtame in vitro transkriptsiooni (IVT) mRNA kohta, sealhulgas traditsioonilist IVT reaktsioonisüsteemi, mida kasutatakse laboritooriumimastikul, ning IVT reaktsioonisüsteemi, mis sobib üleliigse pikkusega mRNA jaoks (>9000 nukleotiidi).

Reageentisettid võimaldavad koos transkriptsiooniga toimuva "capping" protsessi CleanCap AG-ga ja vähendavad immunogeenust m1ψ abil. DNase I eemaldab jäänud DNA-d. Madal tootlus võib olla tingitud halvast segamisest, reageentide oksigeenimisest või DNA-mallide probleemidest, mida saab vältida sentrifuugimisega, uute reageentide kasutamisega, kontrollide abil ning malli koguse või reaktsiooniaja kohandamisega.

Yaohai Bio-Pharma pakub mitmesuguseid eelvalmistatud IVT RNA tooteid (vedelik/võrekuivendatud pulb) ja LNP lõplikke tooteid, mis kodeerivad protseine nagu fluoresentsed protseined (eGFP, mCHERRY), luciferase, rekombinaas Cre ja antigeen OVA, et rahuldada erinevaid eksperimentaalseid või projektide vajadusi.

Ülja-mRNA jaoks IVT süsteem

Tavaline IVT ei pruugi töötada liiga pikkade mRNA (>9000 nt) puhul. On vaja sügavamat arusaama ja ratsionaalset kohandamist IVT komponentidega.

DNA mall: Lineariseeritud plasmidid või PCR tooted vastavate promotorjada jadaga, lahustatud RNase-vaba H2O's. Soovitatakse kasutada DNA malli konsentratsiooni üle 40 nM optimaalsete IVT tingimuste saavutamiseks.

DTT: Säilitab enzyymi aktiivsust transkriptsiooni ajal. Optimaalse enzyymi aktiivsuse tagamiseks tuleb reaktsioonibufferi juurde lisada uus DTT.

RNase inhibiitor: Inhibeerib RNase aktiivsust ja säilitab mRNA stabiilsust.

T7 RNA polümeeraas: Katalüüsib DNA transkriptsiooni RNA-ks, vastavalt promotorjadale. T7 RNA polümeraasi aktiivsust mõjutavad pH ja magneesiumioonid.

Magneesiumioonid (Mg2+): RNA polümeraasi koefaktor. Liiga madalad kontsentratsioonid vähendavad transkriptsiooni efektiivsust, samas kui liiga kõrked võivad viia RNA hajumiseni. Vaba [Mg2+] tuleb kohandada nukleotiidi konetsentratsiooni põhjal. Iga nukleotiit sidub ühe [Mg2+], seega peaks [Mg2+] kontsentratsioon olema suurem kui nukleotiidide kokkuarvutatud kontsentratsioon.

Nukleosiiditriefosfaadid (NTP): Kui substraatide nähtena on NTP-d RNA põhiühikud. NTP kontsentratsioonid üle 7 mM toovad kaasa positiivse mõju mRNA tootmisele.

Spermiin: Stabiilistab DNA-enzyme kompleksid ja stimuleerib transkriptsioonireaktsioone; aga liiga kõrgeid kontsentratsioone võib olla inhibiitsioonimõju. Soovitatav spermiini kontsentratsioon on vahemikus 1–3 mM.

Inorgaaniline pirofosfaatase (PPase): Lisatud IVT reaktsioonidesse, et vältida inorgaaniliste pirosklaasiionide (PPi) akumuleerimist, vältides nende kahetsust Mg2+ga ja tagades piisavalt vaba Mg2+.

Pioneersliku tehnoloogia ja IVT mRNA kogemuse kasutades pakub Yaohai Bio-Pharma ühepealine IVT RNA teenus, mis hõlmab järjestiku disainimist, IVT RNA ettevalmistamist (m1ψ muudatustega), RNA tsükliseerimist, puhastamist, kuivatatud kuju tootmist, LNP enkapsuleerimist ning kvaliteedikontrolli.

Oleme samuti aktiivselt otsimas institutsioonilisi või isiklike globaalseid partnereid. Pakume tööstuses kõige konkurentsivõimsamat kompensatsiooni. Kui teil on mingeid küsimusi, palun ei esitage kontaktimist: [email protected]