Uuenduslikud kokkupanekutehnikad suuremahuliseks geenisünteesiks

Suurte DNA fragmentide nullist sünteesimise monteerimistehnoloogia on geenisünteesi nurgakivi, mis hõlmab selliseid meetodeid nagu BioBrick™, TAR, BglBrick, Golden Gate, Gibson assembly, CPEC ja Overlap PCR. Seoses praeguse tehnoloogia piirangutega geenipikkuse DNA täpseks sünteesimiseks ühes etapis, on vaja kombineerida in vitro ja in vivo kokkupanekutehnikaid, et koondada segmentidena sünteesitud oligonukleotiidifragmente pikkadeks DNA fragmentideks.

In vitro montaažitehnikad

Need liigitatakse erinevatesse meetoditesse, mis põhinevad fragmendi suurusel ja järjestuse omadustel, kusjuures tööriistaensüümide kasutamise nõue on ühine. DNA polümeraasi meetodil põhinev kattuva PCR on lihtne ja kiire töökorras. BioBricki ja BglBricki meetodid, mis põhinevad isoshisomeeridel, võimaldavad standardiseeritud kokkupanekut, kuigi BioBricki meetod ei sobi liitvalkude jaoks. IIS tüüpi restriktsiooniensüümidel põhinev Golden Gate'i kloonimismeetod võimaldab mitme fragmendi tõhusat sujuvat ligeerimist. Gibsoni montaažimeetod, mis kasutab mitme tööriista ensüümi kombinatsiooni, võimaldab sujuvat ligeerimist fragmentide suurusega, mis ulatuvad mitmesaja kbini. DNA komponentide standardiseeritud disain suurendab olemasolevate fragmentide kasutusmäära.

In vivo montaažitehnikad

Kuigi vitro kokkupandud fragmendid võivad ulatuda mitmesaja kb suuruseni, saagis on sageli ebapiisav, mistõttu on vaja amplifitseerimist, kasutades selliseid organisme nagu Escherichia coli. Üle 20 kb suuruste fragmentide kokkupanemisel kasutatakse sageli organismides rekombinantseid süsteeme, sealhulgas Bacillus subtilis, pärm ja konstrueeritud bakterid. Pärmi kui tavaliselt kasutatavat peremeesorganismi on tunnustatud oma tõhusa homoloogse rekombinatsioonivõime poolest juba aastaid. Seda saab kasutada kuni mitme megabaasi (Mb) pikkuste tehiskromosoomide kokkupanemiseks. Lisaks on Saccharomyces cerevisiae kromosoomide pikkuse suhtes erakordne tolerants, mis annab teoreetilise aluse pärmi kasutamiseks ülipikkade kromosoomide ehitamiseks kõrgemates organismides.

Rakendused

Yaohai Bio-Pharma kasutab geenide sünteesiks peamiselt kahte monteerimismeetodit: ligaasi ja DNA polümeraasi kokkupanekut. Ligaasi kokkupaneku meetod ühendab DNA ligaasi kasutades kattuvad ja hübridiseeritud 5'-fosforüülitud oligonukleotiidi fragmendid kaheahelaliseks DNA-ks. Polümeraasi kokkupaneku meetod kasutab DNA polümeraasi kattuvate oligonukleotiidfragmentide pikendamiseks hübridisatsiooni teel, erineva pikkusega segu saamisega ja lõpuks edukalt kokkupandud täispikkade fragmentide amplifitseerimiseks praimerite abil. Yaohai's võib aidata klientidel täita spetsiifilisi geenisünteesi nõudeid.

Otsime aktiivselt ka institutsionaalseid või individuaalseid globaalseid partnereid. Pakume valdkonna kõige konkurentsivõimelisemat tasu. Kui teil on küsimusi, võtke meiega julgelt ühendust: [email protected]