Fed-partii kääritamise strateegia võimsuse kasutamine

Pichia pastorist kasutatakse laialdaselt erinevate heteroloogsete valkude tootmisel. Kõrge rakutihedusega fermentatsiooni (HCDF) tehnoloogia, mida rakendatakse Fed-Batch söötmise kaudu, on edukalt saavutanud biofarmatseutiliste ravimite ja tööstuslike ensüümide suuremahulise tootmise. Täpselt kontrollitud söötmes võib HCDF-tehnoloogia kasutamine saada suure saagisega, kõrge aktiivsusega ja kulutõhusaid rekombinantseid valke.

Hiljutised uuringud näitavad, et HCDF strateegiate kaudu tehakse jõupingutusi heteroloogsete valkude tootmise ja aktiivsuse suurendamiseks Pichia pastoris'es. HCDF-tehnoloogia võimaldab pingutuseta saavutada kõrgetasemelisi rakuklastreid määratletud söötmes, võimaldades seeläbi omandada HCDF-i kaudu rikkalikult suurenenud aktiivsusega ja väiksemate kuludega rekombinantseid valke. Siiski jääb väljakutseks sobiva HCDF strateegia valimine spetsiifiliste valkude kõrgetasemelise ekspressiooni optimeerimiseks Pichia pastorises.

Kõrge rakutihedusega fermentatsioon (HCDF)

Pichia pastoris paistab silma heteroloogsete valkude tootmisel, eelistatult HCDF jaoks automatiseeritud bioreaktorites. HCDF-il on 3 etappi: glütseroolipartii, söötmine ja metanooli induktsioon. Yaohai Bio-Pharmal on enam kui kümneaastane kogemus mikroobse kääritamise vallas ja see on teenindanud üle 400 projekti. Ettevõttel on laialdased teadmised ja hästi arenenud tehnoloogia, mis võimaldab kasutada erinevaid HCDF strateegiaid valgu tootmise tõhustamiseks.

Metanool toimib nii AOX1 indutseerijana kui ka süsinikuallikana, kuid selle kontsentratsiooni tuleb toksilisuse vältimiseks kontrollida. Erinevate metanooliga söötmisstrateegiate hindamine on Pichia pastoris'e kasvu ja valguekspressiooni optimeerimiseks ülioluline

Metanooli induktsiooni strateegia

Fed-batch HCDF metanooli induktsioonistrateegias hõlmavad olekupõhised induktsioonistrateegiad juhtimismetoodikate komplekti, mis reguleerivad metanooli täiendavat lisamist online/offline või edasi-/tagurpidi juhtimise kaudu. Statistilise induktsiooni strateegiate hulgas on peamised μ-stat, lahustatud hapniku (DO)-stat, metanool-stat ja biomass-stat.

1.1 μ-stat

μ-stat strateegia hoiab biomassi stabiilsena, kontrollides μ, aidates kaasa reprodutseeritavusele ja uurides μ mõju valgu ekspressioonile. Sellel puudub aga otsene metanooli ja DO kontroll, mis ohustab kogunemist ja ROS teket.

1.2 DO-stat

DO-stat strateegia reguleerib kaudselt metanooli sööta, kontrollides lahustunud hapnikku, et säilitada hapnikuga varustamine, kuid see ei fikseeri metanooli kontsentratsiooni ja kasvukiirust, mis võib mõjutada valgu ekspressiooni uurimist. Hapnikuga varustamine kujutab endast väljakutset aeroobses kääritamises ja kuigi puhta hapniku lisamine võib olla kulukas ja mürgine, on rõhu suurendamine ökonoomsem lähenemisviis, mis võib samuti suurendada valgu aktiivsust.

1.3 Metanool-stat

Metanooli kontsentratsiooni ebapiisav kontroll seab piiranguid nii μ-stat kui ka DO-stat strateegiatele. Metanooli statistilised strateegiad, mis töötavad sisse- ja väljalülitatud režiimis, on altid kõikumisele ja puuduvad täpsuses. Seevastu PID-kontrollerid pakuvad metanoolikontsentratsiooni täpsemat reguleerimist, suurendades üldist kääritamise efektiivsust.

1.4 Biomass-stat

Biomassi statistika strateegia määratleb seose biomassi ja metanooli söötmise vahel, optimeerides metanooli söötmiskiirust, et suurendada valgu saagikust. Biomassi veebiseire on praktilisem, eelistatud meetod on voolutsütomeetria. 1000 liitri skaalal parandab metanooli etteande kiiruse optimeerimine oluliselt ensüümide aktiivsust, saagist ja tootlikkust, ületades kolvis fermentatsiooni.

Koostoitmise strateegia

Glütserool kui AOX1 promootori inhibiitor tuleb enne metanooli induktsiooni täielikult ära tarbida, et vältida valgu tootmise pärssimist. Kaassubstraadid võivad suurendada ensüümi aktiivsust, kuid liigne glütserool võib kahjustada kasvu ja ekspressiooni. Sorbitool, askorbiinhape, mannitool ja teised võivad glütserooli asendada, vähendades proteolüüsi ja kultiveerimisaega ning suurendades valgu ekspressiooni.

Tüvepank nõuab sobivate säilitusmeetodite kasutuselevõtmist ja paigutamist sobivasse keskkonda, et säilitada tüveomaduste stabiilsus. Yaohai Bio-Pharma suudab täita glütseroolivarude säilitamise (ülimadala temperatuuriga sügavkülmiku või vedela lämmastiku kaudu) ning pärmi ja E. coli külmkuivatussäilitamise nõudeid.

Piirangutest tingitud strateegia

Pichia pastoris'e puhul suurendavad piiravad tingimused nagu madal DO, metanooli kontsentratsioon ja hapnikupiirang rekombinantse valgu ekspressiooni. Piiratud hapnikusisaldusega tingimused aktiveerivad AOX1 promootori metanooli akumuleerumise kaudu, suurendades valgu väljundit, vähendades samal ajal kuumust. Madala temperatuuriga induktsioon suurendab saagikust, aktiivsust, stabiilsust ja rakkude elujõulisust, kuid lisab jahutuskulusid. PH ja lämmastiku piiramine soodustavad ka ekspressiooni, mis nõuab ettevaatust, et vältida tööprobleeme. Lämmastiku piiramine suurendab märkimisväärselt valgu spetsiifilist tootlikkust.

Yaohai Bio-Pharma otsib aktiivselt ka institutsionaalseid või individuaalseid ülemaailmseid partnereid ja pakub sektoris kõige konkurentsivõimelisemat tasu. Kui teil on küsimusi, võtke meiega julgelt ühendust: [email protected]