Eficiencia de limitación 5' del ARNm
La importancia del análisis de eficiencia del límite 5 del ARNm
La estructura de tapa ubicada en el extremo 5 'del ARNm desempeña un papel fundamental en la traducción, estabilización y transporte eficiente de los ARNm dentro de los eucariotas. En el contexto del ARNm transcrito in vitro (IVT), la tapa 5' se introduce mediante procesos de protección cotranscripcional o de protección enzimática. Como componente indispensable de los ARN IVT, la tapa de 5 ′ se erige como un atributo de calidad crítico (CQA) que requiere una caracterización integral durante todo el desarrollo del proceso y la liberación del lote.
Yaohai-Bio Pharma ofrece soluciones integrales de análisis de eficiencia de limitación de 5', que abarcan el diseño de férulas (sonda) de oligonucleótidos, escisión de RNasa H, cromatografía líquida de alto rendimiento de fase reversa de pares iónicos IP-RP (IP-RP-HPLC)/cromatografía líquida -espectrometría de masas (LC-MS), análisis de datos.
Requisitos reglamentarios para la integridad del ARNm
Según las consideraciones regulatorias de la OMS, “la integridad de la estructura del ARNm se considera un atributo de calidad crítico para la liberación del ARNm. Por lo tanto, se necesita control de la integridad del ARNm, la eficacia de la protección en 5', la presencia o longitud de la cola poli(A) en 3', etc.
Método analítico
Analisis | Métodos |
Eficiencia de limitación 5' del ARNm | LC-MS después de la digestión |
Procedimiento
Paso 1. Diseño de férulas (sonda) de oligonucleótidos
La sonda de escisión, que incorpora 2'-O-metilnucleótidos y tetradesoxirribonucleótidos, sirve para escindir una cadena de ARN complementaria en posiciones específicas cuando está presente la RNasa H. Este método resulta muy valioso para la generación específica de fragmentos de ARN más grandes.
Paso 2. Escisión de la RNasa H
Se aplica una sonda biotinilada, estratégicamente diseñada para ser complementaria al extremo 5' del ARNm, junto con la RNasa H para catalizar la escisión dirigida del oligonucleótido del extremo 5' que posee una estructura de tapa.
Paso 3. IP-RP-HPLC/LC-MS
En el análisis LC-MS de oligonucleótidos, el modo cromatográfico preferido son las separaciones de fase reversa por emparejamiento iónico (IP-RP) que utilizan aditivos de fase móvil de amina. Esto se atribuye a su poder de resolución superior y a su compatibilidad con la espectrometría de masas (MS).
Etapa 4. Análisis de los datos
Las masas distintas observadas en los fragmentos de escisión que presentan una tapa m7GpppG, en contraste con aquellos con una tapa de difosfato, trifosfato o G no metilada (GpppG), facilitan su identificación y permiten estimar la eficiencia de la tapa.
Caso de análisis de eficiencia de limitación con LC-MS
Yaohai-Bio Pharma ha desarrollado métodos sólidos para el análisis de la eficiencia de limitación del ARNm, desde el diseño de férulas (sonda) de oligonucleótidos, la escisión de la RNasa H, IP-RP-HPLC/LC-MS hasta el análisis de datos.
Los cromatogramas de iones totales (izquierda) y los espectros de masas por electropulverización (derecha) de los fragmentos de escisión del extremo 5'.
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