تحضير mRNA IVT

النسخ المختبري (IVT) هو الطريقة المفضلة لإعداد mRNA، القادرة على إنتاج ميكروجرامات إلى مليجرامات من mRNA على نطاق المختبر. لأغراض البحث، طور موردو الكواشف أنظمة تفاعل IVT متعددة الاستخدامات مناسبة لـ mRNA بطول متوسط ​​(1000-4000 نوكليوتيد).

في هذه المقالة، سوف نقوم بتلخيص النسخ المختبري (IVT) لـ mRNA، بما في ذلك نظام تفاعل IVT التقليدي المستخدم على نطاق المختبر ونظام تفاعل IVT المناسب لـ mRNA الطويل للغاية (>9000 نوكليوتيد).

تتيح الطقمات التغطية المشتركة باستخدام CleanCap AG وتقليل المناعة باستخدام m1ψ. يزيل DNase I بقايا الحمض النووي. يمكن أن يكون العائد المنخفض بسبب سوء الخلط أو أكسدة الكاشف أو مشكلات قالب الحمض النووي، والتي يمكن التخفيف منها عن طريق الطرد المركزي والكواشف الجديدة والضوابط وضبط كمية القالب/وقت التفاعل.

توفر Yaohai Bio-Pharma مجموعة متنوعة من منتجات IVT RNA الجاهزة (مسحوق مجفف بالتجميد/سائل) ومنتجات LNP النهائية، التي تشفر البروتينات مثل البروتينات الفلورية (eGFP، mCHERRY)، وluciferase، وrecombinase Cre، وantigen OVA، لتلبية الاحتياجات التجريبية أو المشاريع المختلفة.

نظام IVT لـ mRNA الطويل للغاية

قد لا تنجح تقنية IVT التقليدية في حالة mRNA الطويل جدًا (>9000 nt). هناك حاجة إلى فهم عميق وتعديل منطقي لمكونات IVT.

قالب الحمض النووي: بلازميدات خطية أو منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل مع تسلسلات المحفز المقابلة، مذابة في H2O خالية من RNase. يوصى بتركيز قالب DNA أعلى من 40 نانومول للحصول على ظروف IVT مثالية.

دي تي تي: يحافظ على نشاط الإنزيم أثناء النسخ. يجب إضافة DTT جديد إلى عازل التفاعل للحصول على نشاط إنزيمي مثالي.

مثبط RNase: يثبط نشاط RNase ويحافظ على استقرار mRNA.

بوليميراز الحمض النووي الريبوزي T7: يحفز نسخ الحمض النووي إلى الحمض النووي الريبي، بما يتوافق مع تسلسل المحفز. يتأثر نشاط بوليميراز الحمض النووي الريبي T7 بدرجة الحموضة وأيونات المغنيسيوم.

أيونات المغنيسيوم (Mg2+): عامل مساعد لبوليميراز الحمض النووي الريبي. تؤدي التركيزات المنخفضة جدًا إلى تقليل كفاءة النسخ، في حين تؤدي التركيزات المرتفعة جدًا إلى تدهور الحمض النووي الريبي. يجب تعديل [Mg2+] الحر بناءً على تركيز النوكليوتيدات. كل نوكليوتيد يخلب [Mg2+] واحدًا، لذا يجب أن يتجاوز تركيز [Mg2+] تركيز النوكليوتيد الإجمالي.

ثلاثي فوسفات النوكليوسيد (NTP): باعتبارها ركائز، تعد NTPs الوحدات الأساسية للحمض النووي الريبي. وتركيزات NTP التي تزيد عن 7 مليمول لها تأثير إيجابي على إنتاج mRNA.

سبيرميدين: يعمل على تثبيت مركبات الحمض النووي والإنزيمات ويحفز تفاعلات النسخ؛ ومع ذلك، فإن التركيزات المفرطة لها تأثيرات مثبطة. يتراوح تركيز السبيرميدين الموصى به بين 1 و3 مليمول.

بيروفوسفاتاز غير عضوي (PPase): يضاف إلى تفاعلات IVT لمنع تراكم أيونات البايروفوسفات غير العضوية (PPi)، وتجنب ارتباطها بـ Mg2+ وضمان كمية كافية من Mg2+ الحرة.

من خلال الاستفادة من التكنولوجيا الرائدة وخبرة IVT mRNA، تقدم Yaohai Bio-Pharma خدمة IVT RNA الشاملة، والتي تشمل تصميم التسلسل، وإعداد IVT RNA (مع تعديلات m1ψ)، وتدوير RNA، والتطهير، والتجفيف بالتجميد، وتغليف LNP، واختبار الجودة.

كما أننا نبحث بنشاط عن شركاء عالميين مؤسسيين أو فرديين. نحن نقدم التعويض الأكثر تنافسية في هذه الصناعة. إذا كان لديك أي أسئلة، فلا تتردد في الاتصال بنا: [email protected]