إعداد mRNA عن طريق IVT

النقل الوراثي في المختبر (IVT) هو الطريقة المفضلة لإعداد الحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA)، حيث يمكنها إنتاج ميكروغرامات إلى مليغرامات من mRNA على مستوى المختبر. ولأغراض البحث، طور موردو المواد الكيميائية أنظمة تفاعل IVT متعددة الاستخدامات مناسبة لـ mRNA ذي الطول المعتدل (1000-4000 نوكليوتيد).

في هذه المقالة، سنلخص النقل الوراثي في المختبر (IVT) للحمض النووي الريبوزي الرسول، بما في ذلك نظام التفاعل التقليدي المستخدم على مستوى المختبر ونظام التفاعل المناسب لـ mRNA الطويل جدًا (>9000 نوكليوتيد).

تُمكّن الأدوات من وضع القبعات أثناء عملية النقل باستخدام CleanCap AG وتقليل المناعة الذاتية باستخدام m1ψ. يقوم إنزيم DNase I بإزالة الحمض النووي المتبقّي. يمكن أن يكون الإنتاج المنخفض نتيجة خلط غير جيد، أو أكسدة المواد الكيميائية، أو مشاكل في قالب الحمض النووي DNA، والتي يمكن التخفيف منها عن طريق الترسيب، واستخدام مواد كيميائية جديدة، والتحكم، وتعديل كمية القالب/وقت التفاعل.

توفّر شركة ياوهاي بايو-فارما مجموعة متنوعة من منتجات الـ RNA المُحَضَّر مسبقًا (سائل/مسحوق مجفف بالتجميد) ومنتجات LNP النهائية، التي تحتوي على بروتينات مشفرة مثل البروتينات الفلورية (eGFP, mCHERRY)، واللوسيفيراز، وإعادة التشكيل Cre، والمستضد OVA، لتلبية احتياجات التجارب أو المشاريع المختلفة.

نظام IVT للـ mRNA الفائق الطول

قد لا يعمل النظام التقليدي لـ IVT مع الـ mRNA الطويل جدًا (>9000 نوكليوتيد). يتطلب ذلك فهمًا عميقًا وتعديلًا منطقيًا للمكونات المستخدمة في عملية IVT.

قالب DNA: بلازميدات تم تخطيطها أو منتجات PCR تحتوي على سلاسل مرقمة ذات تسلسل مروج متوافق، محلولة في H2O خالية من RNase. يُوصى باستخدام تركيز قالب DNA أعلى من 40 نانومول/لتر لتحقيق ظروف IVT المثلى.

DTT: يحافظ على نشاط الإنزيم أثناء النسخ. يجب إضافة DTT طازجة إلى محلول التفاعل للحفاظ على النشاط الإنزيمي الأمثل.

مثبط RNase: يمنع نشاط RNase ويحافظ على استقرار الـ mRNA.

إنزيم T7 RNA Polymerase: تُحفّز تحويل الحمض النووي إلى حمض نووي ريبوزي، وفقًا لتوالي المروِّج. تتأثر نشاط إنزيم بوليمراز RNA من T7 بالـ pH وأيونات المغنيسيوم.

أيونات المغنيسيوم (Mg2+): عامل مساعد لإنزيم بوليمراز RNA. التركيزات المنخفضة جدًا تقلل من كفاءة النسخ، بينما التركيزات العالية جدًا تؤدي إلى تحلل RNA. يجب ضبط [Mg2+] الحر بناءً على تركيز النوكليوتيدات. كل نوكليوتيد يربط أيون [Mg2+] واحد، لذلك يجب أن يكون تركيز [Mg2+] أعلى من إجمالي تركيز النوكليوتيدات.

ثلاثيات فوسفات النوكليوسيد (NTP): كمواد أولية، تعتبر NTP الوحدات الأساسية للحمض النووي الريبوزي. يُلاحظ تأثير إيجابي على إنتاج mRNA عند تركيزات NTP فوق 7 mM.

سبيرمدين: يثبّت معقدات الحمض النووي-الإنزيم ويحفّز réactions الترجمة؛ ومع ذلك، فإن التركيزات الزائدة لها تأثيرات مثبطة. يُوصى باستخدام تركيز سبيرمدين يتراوح بين 1 و3 mM.

بيروفوسفاته غير العضوية (PPase): أُضيف إلى تفاعلات IVT لمنع تراكم أيونات البايروفسفات غير العضوية (PPi)، وتلافي تفاعلها مع Mg2+ وضمان توفر كمية كافية من Mg2+ الحر.

باستخدام التكنولوجيا الرائدة والخبرة في IVT mRNA، تقدم Yaohai Bio-Pharma خدمة شاملة لـ IVT RNA، تشمل تصميم التسلسل، إعداد IVT RNA (مع تعديلات m1ψ)، تدوير RNA، التنقية، التجفيف بالتجميد، تغليف LNP، واختبار الجودة.

نحن نبحث أيضًا بنشاط عن شركاء عالميين من المؤسسات أو الأفراد. نقدم أكثر التعويضات تنافسية في الصناعة. إذا كان لديك أي أسئلة، لا تتردد في التواصل معنا: [email protected]