Em comparação com o método de capping enzimático em duas etapas, o método de co-transcrição em uma etapa pode reduzir significativamente o fluxo do processo. O método é orientado para o resultado e envolve a adição de análogos de cap à reação de transcrição in vitro (IVT). Os análogos de cap podem ser introduzidos no início da transcrição, e mRNA com estrutura de cap pode ser obtido ao final da transcrição. Os atuais análogos de cap de terceira geração podem evitar o capping reverso e adicionar diretamente a estrutura Cap 1 ao produto da transcrição.
Para considerações sobre a imunogenicidade in vivo do mRNA e a eficiência de tradução, o processo IVT frequentemente utiliza certos tipos de NTPs modificados, e os nucleotídeos modificados mais comuns são pseudouridina (Ψ), N1-metil-pseudouridina (N1Ψ) e citosina-5-metil (5mC).
Figura: Diagrama da Reação de Co-transcrição e Capping do mRNA
Serviço |
Detalhes do Serviço |
Prazo de Entrega (dia útil) |
Co-transcrição de capping |
Resposta transcricional in vitro (análogo de Clean Cap) | 1-2 |
Modificações de nucleotídeos (Ψ/N1Ψ/5mC) | ||
Remoção do template de DNA (DNAse I) | ||
Otimização da condição IVT - opcional |
Design e otimização dos componentes da reação | 3-7 |
Várias estratégias opcionais de modificação de nucleotídeos podem melhorar a expressão de proteínas.
Alcançar uma alta taxa de transcrição e alta eficiência de capping.
Alcance uma taxa de tampão de mais de 95%.
Previna a degradação do mRNA eficazmente controlando estritamente a RNase no ambiente experimental e nos materiais de consumo.
A Yaohai Bio-Pharma desenvolveu uma plataforma madura para o processo de tampão co-transcricional, utilizando análogos limpos de cap para adicionar diretamente a estrutura Cap1, evitando ao mesmo tempo o tampão reverso. Após o pré-tratamento padronizado da amostra e a detecção por eletroforese capilar (CE), a taxa de tampão do mRNA de proteína fluorescente verde aprimorada (eGFP) pode atingir mais de 95%.
eficiência de tampão do mRNA de eGFP superior a 95%
Os mRNAs de eGFP e mCherry preparados por tampão co-transcricional são transfetados em células 293T, respectivamente, e um sinal fluorescente forte é observado após 48h, sugerindo que o mRNA é expresso de forma eficiente nas células 293T.
Expressão dos mRNAs de eGFP e mCherry na Célula 293T