Wykorzystanie mocy strategii fermentacji fed-batch Polska

Pichia pastoris jest szeroko stosowana w produkcji różnych heterologicznych białek. Technologia High-Cell-Density Fermentation (HCDF), wdrożona poprzez karmienie Fed-Batch, z powodzeniem umożliwiła produkcję biofarmaceutyków i enzymów przemysłowych na dużą skalę. W precyzyjnie kontrolowanych mediach wykorzystanie technologii HCDF pozwala uzyskać białka rekombinowane o wysokiej wydajności, wysokiej aktywności i opłacalności.

Najnowsze badania wskazują, że poprzez strategie HCDF podejmowane są wysiłki w celu zwiększenia produkcji i aktywności heterologicznych białek w Pichia pastoris. Technologia HCDF umożliwia bezproblemowe osiągnięcie klastrów komórek wysokiego poziomu w zdefiniowanych mediach, umożliwiając tym samym pozyskiwanie obfitych białek rekombinowanych o zwiększonej aktywności i obniżonych kosztach poprzez HCDF. Jednak wybór odpowiedniej strategii HCDF w celu optymalizacji ekspresji na wysokim poziomie określonych białek w Pichia pastoris pozostaje wyzwaniem.

Fermentacja o wysokiej gęstości komórek (HCDF)

Pichia pastoris jest doskonała w heterologicznej produkcji białka, preferowanej w przypadku HCDF w zautomatyzowanych bioreaktorach. HCDF ma 3 etapy: wsad glicerolowy, podawanie i indukcja metanolu. Yaohai Bio-Pharma może pochwalić się ponad dziesięcioletnim doświadczeniem w fermentacji mikrobiologicznej i obsłużyła ponad 400 projektów. Firma posiada rozległe doświadczenie i dobrze rozwiniętą technologię, co pozwala jej wykorzystywać różne strategie HCDF w celu poprawy wydajności produkcji białka.

Metanol służy zarówno jako induktor AOX1, jak i źródło węgla, ale jego stężenie musi być kontrolowane, aby zapobiec toksyczności. Ocena różnych strategii podawania metanolu jest kluczowa dla optymalizacji wzrostu Pichia pastoris i ekspresji białka

Strategia indukcji metanolu

W strategii indukcji metanolu HCDF fed-batch, strategie indukcji oparte na stanie obejmują zestaw metodologii kontroli, które regulują dodawanie uzupełniające metanolu poprzez sterowanie online/offline lub forward/reverse. Spośród strategii indukcji statystycznej, główne z nich obejmują μ-stat, Dissolved Oxygen (DO)-stat, methanol-stat i biomass-stat.

1.1 μ-stat

Strategia μ-stat utrzymuje biomasę na stałym poziomie poprzez kontrolowanie μ, wspomaganie odtwarzalności i badanie wpływu μ na ekspresję białka. Jednak brakuje jej bezpośredniej kontroli metanolu i DO, co stwarza ryzyko akumulacji i generowania ROS.

1.2 DO-stat

Strategia DO-stat pośrednio reguluje dopływ metanolu poprzez kontrolowanie rozpuszczonego tlenu w celu utrzymania natlenienia, ale nie ustala stężenia metanolu i tempa wzrostu, co może mieć wpływ na badanie ekspresji białka. Natlenienie stanowi wyzwanie w fermentacji tlenowej, a podczas gdy suplementacja czystego tlenu może być kosztowna i toksyczna, zwiększenie ciśnienia jest bardziej ekonomicznym podejściem, które może również zwiększyć aktywność białka.

1.3 Metanol-stat

Niewystarczająca kontrola stężenia metanolu ogranicza strategie μ-stat i DO-stat. Strategie statystyczne dotyczące metanolu, które działają w trybie włącz/wyłącz, są podatne na wahania i brakuje im precyzji. Z kolei regulatory PID oferują dokładniejszą regulację stężenia metanolu, zwiększając ogólną skuteczność fermentacji.

1.4 Statystyka biomasy

Strategia biomass-stat definiuje związek między biomasą a podawaniem metanolu, optymalizując tempo podawania metanolu w celu zwiększenia wydajności białka. Monitorowanie biomasy online jest bardziej praktyczne, a preferowaną metodą jest cytometria przepływowa. W skali 1000 l optymalizacja tempa podawania metanolu znacznie poprawia aktywność enzymów, wydajność i produktywność, przewyższając fermentację w kolbie.

Strategia współkarmienia

Glicerol, jako inhibitor promotora AOX1, musi zostać w pełni zużyty przed indukcją metanolem, aby uniknąć zahamowania produkcji białka. Współsubstraty mogą zwiększać aktywność enzymu, ale nadmiar glicerolu może zaszkodzić wzrostowi i ekspresji. Sorbitol, kwas askorbinowy, mannitol i inne mogą zastąpić glicerol, skracając czas proteolizy i hodowli oraz zwiększając ekspresję białka.

Bank szczepów wymaga przyjęcia odpowiednich metod konserwacji i umieszczenia w odpowiednim środowisku, aby zachować stabilność cech szczepu. Yaohai Bio-Pharma może spełnić wymagania dotyczące konserwacji zapasów glicerolu (za pomocą zamrażarek o bardzo niskiej temperaturze lub ciekłego azotu) oraz konserwacji liofilizacyjnej drożdży i E. coli.

Strategia wywołana ograniczeniami

W Pichia pastoris, warunki ograniczające, takie jak niski DO, stężenie metanolu i limit tlenu, zwiększają ekspresję rekombinowanego białka. Warunki ograniczone tlenem aktywują promotor AOX1 poprzez akumulację metanolu, zwiększając produkcję białka przy jednoczesnym zmniejszeniu ciepła. Indukcja w niskiej temperaturze zwiększa wydajność, aktywność, stabilność i żywotność komórek, ale zwiększa koszty chłodzenia. Ograniczenie pH i azotu również wspomaga ekspresję, wymagając ostrożności, aby uniknąć problemów operacyjnych. Ograniczenie azotu wyraźnie zwiększa specyficzną produktywność białka.

Yaohai Bio-Pharma aktywnie poszukuje również instytucjonalnych lub indywidualnych partnerów globalnych i oferuje najbardziej konkurencyjne wynagrodzenie w branży. Jeśli masz jakiekolwiek pytania, skontaktuj się z nami: [email protected]