Fermentācijas spēka izmantošana fed-batch stratēģijā

Pichia pastoris tiek plaši izmantota dažādu heterologu oliecību ražošanā. Augstas līdzekļu blīvuma fermentācijas (HCDF) tehnoloģija, kas īstenota caur Fed-Batch barojumu, veiksmīgi ir sasnieguši lielmašstabu biofarmaceitisko un rūpniecisku enzīmu ražošanu. Precīzi kontrolētā vidē HCDF tehnoloģijas izmantošana var iegūt augstas ražības, augstas aktivitātes un ekonomiskus rekombinantu oliecību produktus.

Nesenie pētījumi norāda, ka, izmantojot HCDF stratēģijas, tiek veiktas pūles, lai palielinātu heterologu oliecību ražošanu un aktivitāti Pichia pastoris. HCDF tehnoloģija ļauj viegli sasniegt augstas līmeņa šūnu klasterus noteiktā vidē, kas ļauj iegūt bagātus ar rekombinantu oliecībām ar paaugstinātu aktivitāti un samazinātiem izmaksām, izmantojot HCDF. Tomēr piemērotās HCDF stratēģijas izvēle, lai optimizētu konkrētu oliecību augstu izteicienu Pichia pastoris, joprojām ir izaicinājums.

Augstas līdzekļu blīvuma fermentācija (HCDF)

Pichia pastoris izcīnājas heteroloģisko proteīnu ražošanā, kas tiek izmantota HCDF automātiskos bioreaktoru sistēmās. HCDF ir 3 posmi: glicerīna masas, barojums un metanolindukcija. Yaohai Bio-Pharma spēj uzskaitīt vairāk nekā desmit gadu pieredzi mikrobiālās fermentācijas jomā un ir veikusi vairāk nekā 400 projektus. Uzņēmums ieguva plašu pieredzi un attīstījuši tehnoloģijas, kas ļauj lietot dažādus HCDF pieejasveidus, lai uzlabotu proteīnu ražošanas efektivitāti.

Metanols tiek izmantots gan kā AOX1 inducers, gan kā sēnču avots, tomēr tā koncentrācija jākontrolē, lai novērstu toksiskumu. Atšķirīgu metanola barojuma stratēģiju novērtēšana ir būtiska, lai optimizētu Pichia pastoris augšanas procesu un proteīnu izpausmi.

Metanola indukcijas stratēģija

Stratēģijā HCDF metanolindukcijas federētajā partijā, stāvokļa bāzētās indukcijas stratēģijas ietver kontroles metodoloģiju kopu, kas regulē papildu metanolas pievienošanu caur tiešsaistes/nedaudzajiem vai priekšlaicīgu/atpakaļu kontroli. Starp statistiskajām indukcijas stratēģijām galvenās ir μ-stat, Dissolved Oxygen (DO)-stat, metanol-stat un biomass-stat.

1.1 μ-stat

μ-stat stratēģija uztur biomassu nemainīgu, kontrolējot μ, kas atbalsta atkārtotību un ļauj pētīt μ ietekmi uz olbaltumvielu izteiksmi. Tomēr tai trūkst tiešas metololas un DO kontroles, kas var radīt risku akumulācijai un ROS ražošanai.

1.2 DO-stat

DO-stat stratēģija netiešā kārtā regulē metanolas pievienošanu, kontrollējot izkaisīto skābekli, lai uzturētu oksigenāciju, tomēr tā neatrisina metanolas koncentrācijas un augšanas tempa jautājumus, kas var ietekmēt proteīnu izteiksmes pētījumus. Oksigenācija ir izaicinājums slazdīgas fermentācijas gadījumā, un, lai gan īstā skābekļa papildināšana var būt dārga un toksiska, spiediena palielināšana ir ekonomiskāka pieeja, kas var arī uzlabot proteīnu aktivitāti.

1.3 Metanol-stat

Nepietiekama metanolas koncentrācijas kontrolēšana ierobežo abas μ-stat un DO-stat stratēģijas. Metanol-stat stratēģijas, kas darbojas režīmā 'ieslēgts/izslēgts', ir predisponētas svārstībām un trūkst precizitātes. Tuvākajā laikā PID regulatori piedāvā precīzāku metanolas koncentrācijas regulēšanu, kas uzlabo kopējo fermentācijas efektivitāti.

1.4 Biomases-stat

Biomases-stat stratēģija definē attiecību starp biomasi un metanolu pievienošanu, optimizējot metinolu pievienošanas ātrumu, lai palielinātu olbaltumvielu ražojumu. Tiešsaistes biomases uzraudzība ir praktiskāka, ar plūsmas citometriju būt nolemjamajam metodei. 1000L mērogā metanolu pievienošanas ātruma optimizācija nozīmīgi uzlabo enzīma aktivitāti, ražojumu un produktivitāti, pārspējot skrējienes fermentāciju.

Kopējā pievienošanas stratēģija

Glicerīns kā AOX1 promotoru inhibitoru jāiznīkst pilnībā pirms metinola indukcijas, lai izvairītos no olbaltumvielu ražošanas apspiešanas. Koppielējumi var uzlabot enzīma aktivitāti, bet pārmērīgs glicerīns var kaitēt augšanas procesam un izteiksmes efektivitātei. Sorbitols, askorbīnskābe, manitolis un citi var aizstāt glicerīnu, samazinot olbaltumvielu sadalīšanos un audzēšanas laiku, un uzlabojot olbaltumvielu izteiksmi.

Šķērslu bankas izveide prasa piemērotu saglabāšanas metožu ieviešanu un novietojumu piemērotā vidē, lai uzturētu šķērslu raksturu stabilitāti. Yaohai Bio-Pharma var apmierināt prasības gan saskaņā ar glicerīna saglabāšanas (ar palīdzību ultrazemas temperatūras ledusskapjiem vai vielu azotam) praksēm, gan ar rauga sēklu saglabāšanu dažādu sēnču un E. coli gadījumos.

Ierobežojošās stratēģijas

Pichia pastoris organizmā ierobežojošas apstākļi, piemēram, zema DO, metanolas koncentrācija un skābekļa limits, veicina rekombinantu olbaltumvielu izpausmi. Skābekļa ierobežojumi aktivizē AOX1 promotoru caur metanolas akumulāciju, palielinot olbaltumvielu ražojumu un samazinot siltumu. Zema temperatūra indukcijai veicina ražīguma, aktivitātes, stabilności un līdzdzīvības palielināšanos, tomēr pievienojot izmaksas dēļ sārņošanas procesiem. Arī pH un azota ierobežojumi atbalsta izpausmi, tomēr ir jāuzrauga darbība, lai izvairītos no operatīvo problēmu radīšanas. Azota ierobežojums noteikti palielina specifisko olbaltumvielu ražīgumu.

Yaohai Bio-Pharma arī aktīvi meklē pasaules līmenī iestāžu vai personiskus partnerus, piedāvājot visaugstāko atalgojumu no_brīvās_tirgus. Ja jums ir kādi jautājumi, lūdzu, nekavējoties sazinieties ar mums: [email protected]