Yaohai Bio-Pharma paruošia cirRNR, pagrįstą PIE sistema (egzonų ir intronų derinimas), kuri remiasi I tipo intronų savaiminio susijungimo funkcija, kad būtų pasiekta RNR ciklizacija. PIE struktūra sukurta naudojant T4 td geną arba žuvies tRNR pirmtako geną, o išdėstymas yra toks:
RNR intronas ir pagalbinis egzono fragmentas yra padalinti į dvi dalis (5' galą ir 3' galą), kur 5' galinė seka perkeliama į tikslinės sekos uodegą, o 3' galinė seka įterpiama į priekinę tikslinė seka, o tikslinė geno seka įterpiama viduryje.
Katalizuojant GTP, PIE struktūra lemia kitų nei intronų sekų ciklizavimą. Kartu su pagrįsta ciklizacijos greičio didinimo strategija, Yaohai Bio-Pharma gali pasiekti iki 4 kb sekų ciklizaciją, kai ciklizacijos greitis yra didesnis nei 80%.
1 pav. CirRNR cirkuliacija in vitro, pagrįsta PIE sistema
Procesas | Pasirenkama paslauga | Informacija apie paslaugą | Pristatymo laikotarpis (darbo diena) |
cirRNR sekos projektavimas ir optimizavimas | Kodavimo sekų projektavimas ir optimizavimas |
CDS sekos derinimas CDS kodono optimizavimas |
1 |
Nekoduojančių sekų projektavimas ir optimizavimas |
Intronų ir egzonų sekos projektavimas ir optimizavimas Homologinės rankos sekos projektavimas ir optimizavimas Tarpinių sekos projektavimas ir optimizavimas |
1-2 |
CircRNA komponentai | Biologinės funkcijos | Optimizavimo strategijos | |
Dviejų galų intronų ir egzonų sekos | GTP katalizuojamas intronų savaiminis susijungimas sekų ciklizavimui už introno ribų. | Sukurta pagal T4 td geną arba žuvų taukų tRNR pirmtakų geną. | |
Kodavimas | IRES | Vidinė ribosomų atpažinimo vieta, reguliuojanti cirRNR transliaciją. | Vidinių ribosomų įėjimo vietos (IRES) sekų iš skirtingų virusų šaltinių, pvz., EMCV, CVB3 šaltinių, atranka. |
CDS | Baltymus koduojančios sritys, sekos, koduojančios antigenus, antikūnus ar kitus funkcinius baltymus. | Kodono optimizavimas padidina vertimo lygį; tam tikri neoptimalūs kodonai gali turėti įtakos baltymų lankstymuisi. | |
Nekodavimas | Nekoduojančios sekos | Nukreipkite į miRNR arba baltymus, kad galėtumėte reguliuoti geną arba baltymą. | Nukreipimas į specifines miRNR ar baltymų surišimo vietas gali pakartoti surišimo vietos sekas. |
Yaohai Bio-Pharma pristatė kontrolinį produktą, patobulintą žalią fluorescencinį baltymą (eGFP) cirRNR, kuris yra pagrįstas PIE sistema, kad būtų pasiektas RNR ciklizavimas.
Naudojant įprastą transfekcijos reagentą, eGFP cirRNR yra transfekuojama į 293T ląsteles, o eGFP (žalias) fluorescencinis signalas gali būti aptiktas po 24 val., kuris bus sustiprintas po 48 val. Fluorescencinis signalas vis dar gali būti aptiktas 7 dieną ir 14 dieną po to. transfekcija.
eGFP cirkRNR ekspresijos patvirtinimas in vitro