Découvrir les secrets d'une extraction de plasmide de haute qualité

L'extraction de plasmide est cruciale pour les chercheurs. En tant que vecteurs géniques, les plasmides sont essentiels dans la recherche sur les vaccins et la thérapie génique, où la qualité compte. Les facteurs clés de qualité incluent la proportion superenroulée et le contenu en endotoxines. Les réglementations varient : FDA ≥80%, SMPA ≥85%, NMPA ≥90%, avec <5% d'ADN linéaire/ouvert-circulaire. Les clients préfèrent souvent ≥95% superenroulé. Les niveaux d'endotoxine sont : recherche (>50 EU/µg), transfection (<50 EU/µg), et sans endotoxine (<0.1 EU/µg).

ADN de plasmide superenroulé

Les plasmides d'Escherichia coli incluent des formes superenroulées (SC), ouvert-circulaires (OC) et linéaires (L). Une forte proportion SC augmente l'efficacité de transfection et l'expression. Par exemple, une transfection à 85,45% SC est 2,5 fois plus élevée, et une expression HGF à 93,28% SC est 1,8 fois plus élevée, confirmant la supériorité de l'ADN SC.

ADN circulaire ouvert : Lorsqu'une des brins de l'ADN double brin se casse, la structure surbobée devient plus détendue, formant un plasmide circulaire ouvert ayant un volume plus grand qui migre le plus lentement lors de l'électrophorèse et est positionné en haut.

ADN linéaire : Lorsque les deux brins de l'ADN plasmidique se cassent, une structure linéaire se forme, avec un volume relativement plus petit qui migre plus rapidement que l'ADN circulaire ouvert mais plus lentement que l'ADN surbobé, positionné en deuxième lieu.

ADN surbobé : Les deux hélices s'enroulent ensemble, créant une structure surbobée basée sur l'hélice d'ADN. Il a le plus petit volume et migre le plus rapidement lors de l'électrophorèse, positionné en bas.

Analyse quantitative de la proportion surbobée

Les laboratoires utilisent l'électrophorèse dans un gel d'agarose (AGE) et Gel-Pro Analyzer pour évaluer la proportion surbobée via les images d'électrophorèse. Une image montre 97,539 % d'ADN SC, tandis qu'une autre montre 63,833 % d'ADN SC et 36,167 % d'ADN OC (l'ADN linéaire n'est pas visible).

Le secret des endotoxines dans les plasmides

Les endotoxines sont un composant de la couche externe du mur cellulaire des bactéries à Gram négatif, libérées après la mort ou la lyse bactérienne, contenant des lipopolysaccharides toxiques A. Lors de l'extraction des plasmides, les endotoxines pénètrent dans la solution de lyse, affectant l'efficacité de la transfection et déclenchant des réponses immunitaires non spécifiques, entraînant des faux positifs dans les expériences.

Analyse quantitative et qualitative des endotoxines

Le test de lysat d'amibocyte de Limulus détecte les endotoxines par agglutination avec l'acide 2-kéto-3-désoxyoctonique (KDO) présent dans les lipopolysaccharides (LPS). Il est qualitatif et semi-quantitatif, indiquant la présence d'endotoxines par coagulation ou changement de couleur lorsqu'il est mélangé aux échantillons.

Yaohai Bio-Pharma propose des plasmides supercoillés sans endotoxine. Sous-traiter à Yaohai améliore l'efficacité de la transfection et de l'expression. Les plasmides livrés ont une proportion ≥95 % de SC (en moyenne 85 % ±10 %) et des niveaux d'endotoxine ≤0,1, ≤0,01 ou ≤0,005 EU/μg.

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