Dévoiler les secrets de l'extraction de plasmides de haute qualité

L'extraction de plasmides est cruciale pour les chercheurs. En tant que vecteurs de gènes, les plasmides sont essentiels dans la recherche sur les vaccins et la thérapie génique, où la qualité est importante. Les facteurs de qualité clés comprennent la proportion de plasmides surenroulés et la teneur en endotoxines. Les réglementations varient : FDA ≥ 80 %, SMPA ≥ 85 %, NMPA ≥ 90 %, avec < 5 % d'ADN linéaire/circulaire ouvert. Les clients préfèrent souvent ≥ 95 % d'ADN surenroulé. Les niveaux d'endotoxines sont les suivants : recherche (> 50 EU/µg), transfection (< 50 EU/µg) et sans endotoxines (< 0.1 EU/µg).

ADN plasmidique superenroulé

Les plasmides d'Escherichia coli comprennent l'ADN superenroulé (SC), circulaire ouvert (OC) et linéaire (L). Une proportion élevée de SC augmente l'efficacité et l'expression de la transfection. Par exemple, la transfection d'un plasmide SC à 85.45 % est 2.5 fois plus élevée et l'expression HGF d'un plasmide SC à 93.28 % est 1.8 fois plus élevée, confirmant la supériorité de l'ADN SC.

ADN circulaire ouvert : Lorsqu'un brin d'ADN double brin se brise, la structure superenroulée se détache, formant un plasmide circulaire ouvert avec un volume plus grand qui migre le plus lentement pendant l'électrophorèse et est positionné au sommet.

ADN linéaire : lorsque les deux brins d'ADN plasmidique se rompent, une structure linéaire se forme, avec un volume relativement plus petit qui migre plus rapidement que l'ADN circulaire ouvert mais plus lentement que l'ADN superenroulé, positionné en deuxième position.

ADN superenroulé : deux hélices s'entrelacent et forment une structure superenroulée basée sur l'hélice d'ADN. Elle a le plus petit volume et migre le plus rapidement lors de l'électrophorèse, étant positionnée en bas.

Analyse quantitative de la proportion de superenroulements

Les laboratoires utilisent l'électrophorèse sur gel d'agarose (AGE) et l'analyseur Gel-Pro pour évaluer la proportion superenroulée via des images d'électrophorèse. Une image montre 97.539 % d'ADN SC, tandis qu'une autre montre 63.833 % d'ADN SC et 36.167 % d'ADN OC (ADN linéaire non visible).

Le secret des endotoxines dans les plasmides

L'endotoxine est un composant de la couche externe de la paroi cellulaire des bactéries Gram négatives, libéré après la mort bactérienne ou la lyse, contenant du lipopolysaccharide A toxique. Lors de l'extraction du plasmide, l'endotoxine pénètre dans la solution de lyse, affectant l'efficacité de la transfection et déclenchant des réponses immunitaires non spécifiques, conduisant à de faux positifs dans les expériences.

Analyse quantitative et qualitative des endotoxines

Le test de lysat d'amébocytes de limule (LAL) détecte les endotoxines par agglutination avec l'acide 2-céto-3-désoxyoctonique (KDO) dans le lipopolysaccharide (LPS). Il est qualitatif et semi-quantitatif, indiquant la présence d'endotoxines par coagulation ou changement de couleur lorsqu'il est mélangé à des échantillons.

Yaohai Bio-Pharma propose des plasmides superenroulés sans endotoxines. L'externalisation vers Yaohai augmente l'efficacité de la transfection et de l'expression. Les plasmides livrés ont une proportion SC ≥ 95 % (moyenne 85 % ± 10 %) et des niveaux d'endotoxines ≤ 0.1, ≤ 0.01 ou ≤ 0.005 EU/μg.

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