Optimisation du processus de purification de l'insuline humaine recombinante

Ces dernières années, la croissance du nombre de patients diabétiques a stimulé la demande d'insuline, mais l'insuline abordable est rare. Une production d'insuline efficace et économique est cruciale. Essentiellement produite par Escherichia coli (E. coli) et la levure en raison de sa croissance rapide et de son faible coût, E. coli fait face à un traitement en aval complexe.

Présentation du traitement en aval :

La purification de l'insuline humaine recombinante à partir des corps d'inclusion d'E. coli implique plusieurs étapes, notamment la récupération, le lavage, la solubilisation et l'oxydation, le clivage, l'échange de tampon, la purification chromatographique, la précipitation, la renaturation, le clivage enzymatique et la formulation.

Yaohai Bio-Pharma bénéficie d'une vaste expérience dans la production et la purification d'insuline recombinante, associée à une équipe d'experts, garantissant que votre production d'insuline est réalisée avec une grande efficacité. Tirant parti de notre expérience issue de centaines de projets, Yaohai résume avec gentillesse comment optimiser le processus de purification en aval de l'insuline humaine recombinante.

Récupération et lavage du corps par inclusion :

Les cellules sont désintégrées à l'aide de méthodes mécaniques (telles que l'ultrasonisation, l'homogénéisation à haute pression) ou d'un traitement au lysozyme, suivi de tampons de lavage (contenant de l'urée, du Triton X-100, etc.) pour éliminer les impuretés. Lors du lavage, les paramètres doivent être optimisés pour garantir la qualité des protéines tout en contrôlant les coûts.

Solubilisation et oxydation des corps d'inclusion :

Des dénaturants à haute concentration (tels que le chlorhydrate de guanidine et l'urée) sont utilisés pour solubiliser les corps d'inclusion, avec du dithiothréitol ou du β-mercaptoéthanol ajouté pour empêcher la formation de liaisons disulfures incorrectes. Le pH et la température ont un impact significatif sur les réactions de solubilisation et d'oxydation.

Clivage et échange de tampon :

Le clivage au bromure de cyanogène est utilisé pour éliminer l'acide aminé initiateur N-terminal, mais il pose des problèmes de toxicité et de faible spécificité. Grâce à la dialyse, à l'ultrafiltration ou à la chromatographie d'exclusion de taille, l'échange de tampon élimine les réactifs nocifs en vue des opérations ultérieures.

Purification et précipitation chromatographiques :

Plusieurs techniques chromatographiques sont utilisées pour purifier l'insuline, notamment la chromatographie d'affinité, la chromatographie par échange d'ions, la chromatographie en phase inverse, la chromatographie par interaction hydrophobe et la chromatographie par exclusion de taille. Des méthodes de précipitation, telles que la précipitation par pH et la cristallisation du zinc, sont utilisées pour éliminer les impuretés et concentrer les protéines.

Renaturation :

La protéine solubilisée est diluée dans un tampon de renaturation pour favoriser la formation correcte des liaisons disulfures et le repliement des protéines. La chromatographie liquide de repliement des protéines et la dialyse sont également des méthodes utilisées pour la renaturation.

Clivage enzymatique et formulation :

La trypsine et la carboxypeptidase B sont utilisées pour cliver le peptide C, formant ainsi l'hétérodimère actif de l'insuline. Enfin, la cristallisation et la lyophilisation sont utilisées pour éliminer les sels et tampons résiduels, préparant ainsi une formulation stable. Des additifs spécifiques (tels que le zinc et la protamine) sont ajoutés pour répondre à différents besoins cliniques.

Conclusion:

Traitement en aval de l'insuline à partir de E. coli est complexe. L'accent doit être mis à l'avenir sur l'optimisation de ces étapes pour une production efficace et économique afin de répondre à la demande et de réduire les coûts.

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