Optimisation du processus de purification pour l'insuline humaine recombinante

Ces dernières années, l'augmentation du nombre de patients diabétiques a stimulé la demande d'insuline, mais une insuline abordable est en offre limitée. Une production d'insuline efficace et économique est cruciale. Principalement produite via Escherichia coli (E. coli) et la levure en raison de leur croissance rapide et de leur faible coût, l'E. coli fait face à un traitement en aval complexe.

Aperçu du traitement en aval :

La purification de l'insuline humaine recombinante à partir des corps inclusifs d'E. coli implique plusieurs étapes, y compris la récupération, le lavage, la solubilisation et l'oxydation, la coupure, l'échange de tampon, la purification chromatographique, la précipitation, la renaturation, la coupure enzymatique et la formulation.

Yaohai Bio-Pharma bénéficie d'une vaste expérience dans la production et la purification de l'insuline recombinante, associée à une équipe d'experts, garantissant que votre production d'insuline est réalisée avec un haut niveau d'efficacité. En nous appuyant sur notre expérience acquise à travers des centaines de projets, Yaohai résume aimablement comment optimiser le processus de purification en aval pour l'insuline humaine recombinante.

Récupération et lavage du corps d'inclusion :

Les cellules sont disruptées par des méthodes mécaniques (comme l'ultrasonication, l'homogénéisation à haute pression) ou un traitement au lysozyme, suivi de tampons de lavage (contenant de l'urée, du Triton X-100, etc.) pour éliminer les impuretés. Pendant le lavage, les paramètres doivent être optimisés pour garantir la qualité des protéines tout en contrôlant les coûts.

Solubilisation et oxydation du corps d'inclusion :

Des dénaturants à haute concentration (comme le chlorhydrate de guanidine et l'urée) sont utilisés pour solubiliser les corps d'inclusion, avec ajout de dithiothréitol ou de β-mercaptoéthanol pour éviter la formation de liaisons disulfure incorrectes. Le pH et la température influencent considérablement les réactions de solubilisation et d'oxydation.

Clivage et échange de tampon :

La clivage au bromure de cyanogène est utilisé pour enlever l'acide aminé initial en N-terminale, mais il pose des problèmes de toxicité et de faible spécificité. Par dialyse, ultrafiltration ou chromatographie par exclusion stérique, le changement de tampon élimine les réactifs nocifs en préparation pour les opérations suivantes.

Purification Chromatographique et Précipitation :

Plusieurs techniques chromatographiques sont utilisées pour purifier l'insuline, y compris la chromatographie d'affinité, la chromatographie d'échange ionique, la chromatographie en phase inverse, la chromatographie par interaction hydrophobe et la chromatographie par exclusion stérique. Les méthodes de précipitation, telles que la précipitation par pH et la cristallisation au zinc, sont utilisées pour éliminer les impuretés et concentrer les protéines.

Renaturation :

La protéine solubilisée est diluée dans un tampon de renaturation pour favoriser la formation correcte des liaisons disulfures et du pliage de la protéine. La chromatographie liquide de pliage des protéines et la dialyse sont également des méthodes utilisées pour la renaturation.

Clivage Enzymatique et Formulation :

La trypsine et la carboxypeptidase B sont utilisées pour cliver le peptide C, formant ainsi l'hétérodimère d'insuline actif. Enfin, la cristallisation et la lyophilisation sont employées pour éliminer les sels et tampons résiduels, préparant une formulation stable. Des additifs spécifiques (comme le zinc et la protamine) sont ajoutés pour répondre à différents besoins cliniques.

Conclusion :

Le traitement downstream de l'insuline provenant de E. coli est complexe. L'accent devrait être mis à l'avenir sur l'optimisation de ces étapes pour une production efficace et économique afin de répondre à la demande et réduire les coûts.

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