Odkrywanie sekretów wysokiej jakości ekstrakcji plazmidów

Ekstrakcja plazmidów jest kluczowa dla badaczy. Jako wektory genowe, plazmidy są niezbędne w badaniach nad szczepionkami i terapią genową, gdzie jakość ma znaczenie. Kluczowe czynniki jakościowe obejmują proporcję superskręcenia i zawartość endotoksyn. Przepisy są różne: FDA ≥80%, SMPA ≥85%, NMPA ≥90%, z <5% liniowego/otwarto-kołowego DNA. Klienci często preferują ≥95% superskręcenia. Poziomy endotoksyn to: badania (>50 EU/µg), transfeccja (<50 EU/µg) i bez endotoksyn (<0.1 EU/µg).

Superskręcone DNA plazmidowe

Plazmidy z Escherichia coli obejmują superskręcone (SC), otwarto-koliste (OC) i liniowe (L) DNA. Wysoki udział SC zwiększa wydajność transfeccji i ekspresję. Na przykład transfeccja plazmidu SC 85.45% jest 2.5x wyższa, a ekspresja HGF plazmidu SC 93.28% jest 1.8x wyższa, co potwierdza wyższość DNA SC.

Otwarto-koliste DNA: Gdy pęka jedno pasmo dwuniciowego DNA, superskręcona struktura rozluźnia się, tworząc plazmid o otwartym kolistym kształcie i większej objętości, który migruje najwolniej podczas elektroforezy i jest umiejscowiony na górze.

Liniowe DNA: Gdy oba pasma DNA plazmidowego ulegną pęknięciu, powstaje struktura liniowa o stosunkowo mniejszej objętości, która migruje szybciej niż DNA o strukturze otwartego kola, ale wolniej niż DNA o strukturze superskręconej, zajmująca drugą pozycję.

Superskręcone DNA: Dwie helisy przeplatają się, skręcając się w superskręconą strukturę opartą na helisie DNA. Ma najmniejszą objętość i migruje najszybciej podczas elektroforezy, ulokowana na dole.

Analiza ilościowa proporcji superskręconej

Laboratoria wykorzystują elektroforezę w żelu agarozowym (AGE) i analizator Gel-Pro Analyzer do oceny proporcji superskręconych za pomocą obrazów elektroforezy. Jeden obraz pokazuje 97.539% SC DNA, podczas gdy inny pokazuje 63.833% SC i 36.167% OC DNA (liniowe DNA niewidoczne).

Sekret endotoksyny w plazmidach

Endotoksyna jest składnikiem zewnętrznej warstwy ściany komórkowej bakterii Gram-ujemnych, uwalnianym po śmierci bakterii lub lizie, zawierającym toksyczny lipopolisacharyd A. Podczas ekstrakcji plazmidu endotoksyna przedostaje się do roztworu lizy, wpływając na wydajność transfeccji i wyzwalając niespecyficzne odpowiedzi immunologiczne, co prowadzi do fałszywie dodatnich wyników w eksperymentach.

Analiza ilościowa i jakościowa endotoksyny

Test Limulus amebocyte lysate (LAL) wykrywa endotoksynę poprzez aglutynację z kwasem 2-keto-3-deoxyoctonic acid (KDO) w lipopolisacharydzie (LPS). Jest jakościowy i półilościowy, wskazujący na obecność endotoksyny poprzez koagulację lub zmianę koloru po zmieszaniu z próbkami.

Yaohai Bio-Pharma oferuje superskręcone plazmidy wolne od endotoksyn. Outsourcing do Yaohai zwiększa wydajność transfeccji i ekspresji. Dostarczone plazmidy mają ≥95% udział SC (śr. 85%±10%) i poziomy endotoksyn ≤0.1, ≤0.01 lub ≤0.005 EU/μg.

Aktywnie poszukujemy także partnerów instytucjonalnych lub indywidualnych na całym świecie. Oferujemy najbardziej konkurencyjne wynagrodzenie w branży. Jeśli masz jakiekolwiek pytania, skontaktuj się z nami: [email protected]