Odkrywanie sekretów wysokiej jakości ekstrakcji plazmidów

Wyodrębnianie plazmidów jest kluczowe dla badaczy. Jako wektory genów, plazmidy są niezwykle ważne w badaniach nad szczepionkami i terapią genową, gdzie liczy się jakość. Kluczowe czynniki jakości obejmują proporcję superzwiniętą i zawartość endotoksyn. Regulacje różnią się: FDA ≥80%, SMPA ≥85%, NMPA ≥90%, z mniej niż 5% DNA liniowego/otwarto-kolistego. Klienci często woleją ≥95% DNA superzwiniętego. Poziomy endotoksyn to: badania (>50 EU/µg), transfekcja (<50 EU/µg) i bezendotoksynowy (<0.1 EU/µg).

DNA plazmidowe superzwinięte

Plazmidy pochodzące z Escherichia coli obejmują formy superzwinięte (SC), otwarto-koliste (OC) i liniowe (L). Wysoka proporcja SC zwiększa wydajność transfekcji i ekspresję. Na przykład, transfekcja plazmidu o 85,45% SC jest 2,5 razy wyższa, a ekspresja HGF plazmidu o 93,28% SC jest 1,8 raza większa, co potwierdza przewagę DNA superzwiniętego.

Otwarta-kolisty DNA: Gdy jedna nite dwuniciowego DNA ulega uszkodzeniu, struktura superzwinięta staje się luźniejsza, tworząc otwartą-kolistą plazmidę o większym objętości, która podczas elektroforezy przemieszcza się najwolniej i znajduje się na górze.

Liniowe DNA: Gdy obie nici DNA plazmidowego są przerwane, powstaje struktura liniowa o względnie mniejszym objętości, która przemieszcza się szybciej niż otwarta-kolisty DNA, ale wolniej niż superzwinięte DNA, zajmując drugie miejsce.

Superzwinięte DNA: Dwie helisy splecione są ze sobą, tworząc strukturę superzwiniętą opartą na helisie DNA. Ma ono najmniejszy objętości i podczas elektroforezy przemieszcza się najszybciej, znajdując się na dole.

Analiza ilościowa proporcji superzwiniętego DNA

Laboratoria korzystają z elektroforezy w gelu agarowym (AGE) i Gel-Pro Analyzer do oceny proporcji superzwiniętego DNA za pomocą obrazów elektroforetycznych. Jeden obraz pokazuje 97,539% SC DNA, podczas gdy inny pokazuje 63,833% SC DNA i 36,167% OC DNA (DNA liniowe nie jest widoczne).

Tajemnica endotoksyn w plazomidach

Endotoksyna to składnik zewnętrznej warstwy ścianki komórkowej bakterii gramu ujemnych, wydzielana po śmierci lub lizysie bakterii, zawierająca toksyczne lipopolisacharydy A. Podczas ekstrakcji plazmidów endotoksyna przechodzi do roztworu lizyatu, wpływa na efektywność transfekcji i wywołuje niespecyficzne odpowiedzi immunologiczne, prowadzące do fałszywych wyników dodatnich w doświadczeniach.

Ilościowa i jakościowa analiza endotoksyny

Test Limulus amebocyte lysate (LAL) wykrywa endotoksynę poprzez skupienie się z kwasem 2-keto-3-deoksyoktanowym (KDO) w lipopolisacharydzie (LPS). Jest on jakościowy i półilościowy, wskazując obecność endotoksyny za pomocą zakrzepnięcia lub zmiany koloru po wymieszaniu z próbkami.

Yaohai Bio-Pharma oferuje supercoilowe plazmidy bez endotoksyn. Zlecenie usługi Yaohai zwiększa efektywność transfekcji i ekspresji. Dostarczane plazmidy mają proporcję ≥95% SC (średnio 85%±10%) oraz poziomy endotoksyny ≤0,1, ≤0,01 lub ≤0,005 EU/μg.

Szukamy również globalnych partnerów instytucjonalnych lub indywidualnych. Ofiarowujemy najbardziej konkurencyjne wynagrodzenie w branży. Jeśli masz jakiekolwiek pytania, prosimy o kontakt: [email protected]