Innowacyjne techniki montażu dla szerokomodowej syntezy genów

Technologia montażu do syntezowania dużych fragmentów DNA od zera jest podstawą syntez genów, obejmującą metody takie jak BioBrick™, TAR, BglBrick, Golden Gate, montaż Gibson, CPEC i Overlap PCR. Ze względu na ograniczenia obecnej technologii w dokładnej syntezie DNA o długości genu w jednym kroku, konieczne jest połączenie technik montażu in vitro i in vivo, aby złożyć fragmenty oligonukleotydowe syntetyzowane w segmentach w długie fragmenty DNA.

Techniki montażu in vitro

Klasyfikuje się je na różne metody na podstawie rozmiaru fragmentu i charakterystyk sekwencji, z ogólnym wymaganiem stosowania enzymów narzędzi. Overlap PCR, opierający się na metodzie DNA polimerazy, jest prosty i szybki w obsłudze. Metody BioBrick i BglBrick, które opierają się na izoschizomerach, umożliwiają standardowe montowanie, przy czym metoda BioBrick nie nadaje się do białek fuzyjnych. Metoda klonowania Golden Gate, oparta na enzymach restrykcyjnych typu IIS, pozwala na wydajne bezszwowe ligowanie wielu fragmentów. Metoda Gibsona, która wykorzystuje kombinację wielu enzymów narzędzi, umożliwia bezszwowe ligowanie z rozmiarami fragmentów dochodzącymi do kilkuset kb. Standardowy projekt komponentów DNA zwiększa wykorzystanie istniejących fragmentów.

Techniki montażu in vivo

Choć w vitro rozmiar montowanych fragmentów może osiągać kilkaset kb, często zaś uzyskiwana ilość jest niewystarczająca, co wymaga wzmacniania za pomocą organizmów takich jak Escherichia coli. W przypadku składania fragmentów przekraczających 20 kb, często wykorzystuje się rekombinacyjne systemy w organizmach, w tym Bacillus subtilis, drożdże oraz zmodyfikowane bakterie. Drożdże, jako powszechnie używany gospodarz, od wielu lat są uznawane za swoje zdolności do efektywnej rekombinacji homologicznej. Mogą być wykorzystywane do składania sztucznych chromosomów o długości kilku megabaz (Mb). Ponadto, Saccharomyces cerevisiae wykazuje niezwykłą tolerancję dla długości chromosomu, co stanowi teoretyczną podstawę do wykorzystania drożdży do konstrukcji ultra-długich chromosomów u organizmów wyższych.

Zastosowania

Yaohai Bio-Pharma przede wszystkim wykorzystuje dwie metody montażu podczas syntezy genu: montaż ligazowy i montaż polimerazy DNA. Metoda montażu ligazowego łączy nachodzące i hybrydyzujące na siebie fragmenty oligonukleotydowe z fosforyzacją 5' w kwas DNA dwucząsteczkowy za pomocą ligazy DNA. Metoda montażu polimerazy używa polimerazy DNA do rozszerzania nachodzących fragmentów oligonukleotydowych poprzez hybrydyzację, uzyskując mieszaninę różnych długości, a następnie wytwarzając pełnodługościowe fragmenty połączone pomyślnie przy użyciu iniciatorów. Yaohai może pomóc klientom w zaspokojeniu ich konkretnych wymagań podczas syntezy genu.

Szukamy również globalnych partnerów instytucjonalnych lub indywidualnych. Ofiarowujemy najbardziej konkurencyjne wynagrodzenie w branży. Jeśli masz jakiekolwiek pytania, prosimy o kontakt: [email protected]