Innowacyjne techniki montażu do syntezy genów na dużą skalę

Technologia montażu do syntezy dużych fragmentów DNA od podstaw jest podstawą syntezy genów, obejmującą metody takie jak BioBrick™, TAR, BglBrick, Golden Gate, montaż Gibsona, CPEC i Overlap PCR. Ze względu na ograniczenia obecnej technologii w dokładnej syntezie DNA o długości genu w jednym kroku, konieczne jest połączenie technik montażu in vitro i in vivo w celu złożenia fragmentów oligonukleotydów syntetyzowanych w segmentach w długie fragmenty DNA.

Techniki montażu in vitro

Są one klasyfikowane do różnych metod na podstawie wielkości fragmentu i cech sekwencji, ze wspólnym wymogiem stosowania enzymów narzędziowych. PCR typu Overlap, oparty na metodzie polimerazy DNA, jest prosty i szybki w działaniu. Metody BioBrick i BglBrick, które opierają się na izoschizomerach, umożliwiają standaryzowany montaż, chociaż metoda BioBrick nie nadaje się do białek fuzyjnych. Metoda klonowania Golden Gate, oparta na enzymach restrykcyjnych typu IIS, umożliwia wydajną bezproblemową ligację wielu fragmentów. Metoda montażu Gibsona, która wykorzystuje kombinację wielu enzymów narzędziowych, umożliwia bezproblemową ligację z rozmiarami fragmentów sięgającymi kilkuset kb. Standaryzowany projekt składników DNA zwiększa wskaźnik wykorzystania istniejących fragmentów.

Techniki montażu in vivo

Chociaż in vitro złożone fragmenty mogą osiągnąć rozmiar kilkuset kb, wydajność jest często niewystarczająca, co wymaga amplifikacji przy użyciu organizmów takich jak Escherichia coli. W składaniu fragmentów przekraczających 20 kb często stosuje się rekombinowane systemy w organizmach, w tym Bacillus subtilis, drożdże i modyfikowane bakterie. Drożdże, jako powszechnie używany gospodarz, są znane ze swojej wydajnej zdolności do rekombinacji homologicznej od wielu lat. Mogą być używane do składania sztucznych chromosomów o długości do kilku megabaz (Mb). Ponadto Saccharomyces cerevisiae wykazuje niezwykłą tolerancję na długość chromosomów, co stanowi teoretyczną podstawę do wykorzystania drożdży do konstruowania ultradługich chromosomów w organizmach wyższych.

Zastosowania

Yaohai Bio-Pharma stosuje przede wszystkim dwie metody montażu do syntezy genów: montaż ligazy i montaż polimerazy DNA. Metoda montażu ligazy łączy nakładające się i hybrydyzowane 5'-fosforylowane fragmenty oligonukleotydów w dwuniciowy DNA za pomocą ligazy DNA. Metoda montażu polimerazy wykorzystuje polimerazę DNA do wydłużania nakładających się fragmentów oligonukleotydów poprzez hybrydyzację, uzyskując mieszaninę o różnych długościach i ostatecznie wzmacniając pomyślnie zmontowane fragmenty pełnej długości za pomocą primerów. Yaohai może pomóc klientom spełnić określone wymagania w zakresie syntezy genów.

Aktywnie poszukujemy także partnerów instytucjonalnych lub indywidualnych na całym świecie. Oferujemy najbardziej konkurencyjne wynagrodzenie w branży. Jeśli masz jakiekolwiek pytania, skontaktuj się z nami: [email protected]