IVT mRNA sagatavošana

In vitro transkripcija (IVT) ir iespējamākais mēģinājumu laboratorijas mērogā gatavot mRNA metode, kas spēj sniegt mikrogramus līdz miligramiem no mRNA. Zinātnisku pētījumu mērķim reaktīvo vielu piegādātāji ir izstrādājuši daudzveidīgus IVT reakciju sistēmas, kas piemērotas vidēja garuma (1000-4000 nukleotīdi) mRNA.

Šajā rakstā mēs apkoposim in vitro transkripciju (IVT) no mRNA, iekļaujot konvencionālo IVT reakciju sistēmu, kas tiek izmantota mēģinājumu laboratorijas mērogā, un IVT reakciju sistēmu, kas piemērota supergarai mRNA (>9000 nukleotīdi).

Kompromisi ļauj veikt kopā ar transkripciju noturēt CleanCap AG un samazināt imunogennost ar m1ψ. DNase I noņem atlikušo DNA. Zema ražība var būt izraisīta sliktu maiņu, reaktīvo vielu oksidāciju vai DNA šablonu problēmām, ko var novērst ar centrifugēšanu, jaunu reaktīvo vielu, kontroles un pielāgojot šablona daudzumu/reakcijas laiku.

Yaohai Bio-Pharma piedāvaja dažādus jau iepriekš pagatavotus IVT RNA produktus (dzīvi/līdztušo pulveri) un LNP beigasproduktus, kas kodē proteīnus, piemēram, fluorescējošos proteīnus (eGFP, mCHERRY), luciferāzu, rekombināzi Cre un antigenu OVA, lai apmierinātu dažādas eksperimenta vai projekta vajadzības.

Sistēma ultradarbīgam mRNA IVT

Parastais IVT var nedarboties pārāk garām mRNA (>9000 nt). Ir nepieciešama dziļa sapratne un racionāla IVT sastāvdaļu korekcija.

DNA šablonis: Lineārie plazmidi vai PCR produkti ar atbilstošiem promotoru secībām, risināti RNase brīvā H2O. Optimālām IVT apstākļiem ir ieteicams DNA šablona koncentrācija augstāka par 40 nM.

DTT: Uztur enzīma aktivitāti transkripcijas laikā. Reakcijas buferam būtu jāpievieno frešs DTT, lai sasniegtu optimālo enzīma aktivitāti.

RNase inhibitors: Inhibē RNase aktivitāti un uztur mRNA stabilitāti.

T7 RNA polimeraze: Katalizē DNA transkripciju uz RNA, kas atbilst promotoru sekvenčai. T7 RNA polimerāzes aktivitāte tiek ietekmēta ar pH un magnezija joniem.

Magnēzsioni (Mg2+): RNA polimerāzes koeficients. Parāk zemas koncentrācijas samazina transkripcijas efektivitāti, savukārt parāk augstas koncentrācijas var izraisīt RNA degradāciju. Brīvo [Mg2+] koncentrāciju jāpielasa balstoties uz nukleotīdu koncentrāciju. Katrs nukleotīds šķēl vienu [Mg2+], tāpēc [Mg2+] koncentrācija jāpalielina pāri kopējai nukleotīdu koncentrācijai.

Nukleozīdu trifosfāti (NTP): Kā substraati NTP ir RNA pamateinības. 7 mM un vairāk NTP koncentrācijas pozitīvi ietekmē mRNA ražošanu.

Spermidīns: Stabiliņo DNS-enzīma kompleksus un stimulē transkripcijas reakcijas; tomēr pārmērīgas koncentrācijas var izraisīt inhibējošu ietekmi. Ieteicamā spermidīna koncentrācija ir no 1 līdz 3 mM.

Neorganiskais pirifosfatas (PPase): Pievienots IVT reakcijām, lai novērstu neorganiskā pirofosfāta jonu (PPi) sakumēšanos, izvairoties no to šķīnonas ar Mg2+ un nodrošinot pietiekami daudz brīva Mg2+.

Izmantojot inovatīvo tehnoloģiju un IVT mRNA pieredzi, Yaohai Bio-Pharma piedāvā kopēju IVT RNA pakalpojumu, kas ietver sekvenes dizainu, IVT RNA sagatavošanu (ar m1ψ modifikācijām), RNA ciklizāciju, tīrīšanu, šķidruma aizzemetību, LNP kapsulēšanu un kvalitātes pārbaudi.

Mēs aktīvi meklējam globālus partnerus, gan iestāžu, gan personīgu līmenī. Mēs piedāvājam nozīmē spēcīgāko atalgojumu. Ja jums ir jebkādas jautājumi, lūdzu, nerozdomājiet mūs sazināties: [email protected]