IVT mRNS sagatavošana

In vitro transkripcija (IVT) ir vēlamā metode mRNS sagatavošanai, kas laboratorijas mērogā spēj iegūt no mikrogramiem līdz miligramiem mRNS. Pētniecības nolūkos reaģentu piegādātāji ir izstrādājuši daudzpusīgas IVT reakciju sistēmas, kas piemērotas vidēja garuma (1000–4000 nukleotīdu) mRNS.

Šajā rakstā mēs apkoposim mRNS in vitro transkripciju (IVT), ieskaitot parasto IVT reakcijas sistēmu, ko izmanto laboratorijas mērogā, un IVT reakcijas sistēmu, kas piemērota īpaši garai mRNS (> 9000 nukleotīdi).

Komplekti nodrošina kopīgu transkripcijas ierobežošanu ar CleanCap AG un samazina imunogenitāti ar m1ψ. DNāze I noņem atlikušo DNS. Zemu iznākumu var izraisīt slikta sajaukšana, reaģenta oksidēšana vai DNS veidnes problēmas, ko var mazināt ar centrifugēšanu, svaigiem reaģentiem, kontrolēm un veidnes daudzuma/reakcijas laika pielāgošanu.

Yaohai Bio-Pharma nodrošina dažādus rūpnieciski ražotus IVT RNS produktus (šķidrs/liofilizēts pulveris) un LNP gatavos produktus, kas kodē proteīnus, piemēram, fluorescējošos proteīnus (eGFP, mCHERRY), luciferāzi, rekombināzi Cre un antigēnu OVA, lai apmierinātu dažādus eksperimentālos vai projektus. vajadzībām.

IVT sistēma īpaši garai mRNS

Parastā IVT var nedarboties pārāk garai mRNS (>9000 nt). Ir nepieciešama dziļa izpratne un racionāla IVT komponentu pielāgošana.

DNS veidne: Linearizētas plazmīdas vai PCR produkti ar atbilstošām promotora sekvencēm, izšķīdinātas RNāzes nesaturošā ūdenī. Optimālajiem IVT apstākļiem ieteicama DNS veidnes koncentrācija, kas lielāka par 2 nM.

DTT: Saglabā fermentu aktivitāti transkripcijas laikā. Lai nodrošinātu optimālu enzīmu aktivitāti, reakcijas buferšķīdumam jāpievieno svaigs DTT.

RNāzes inhibitors: Inhibē RNāzes aktivitāti un uztur mRNS stabilitāti.

T7 RNS polimerāze: Katalizē DNS transkripciju RNS, kas atbilst promotora secībai. T7 RNS polimerāzes aktivitāti ietekmē pH un magnija joni.

Magnija joni (Mg2+): RNS polimerāzes kofaktors. Pārāk zemas koncentrācijas samazina transkripcijas efektivitāti, savukārt pārāk augstas koncentrācijas izraisa RNS degradāciju. Brīvais [Mg2+] ir jāpielāgo, pamatojoties uz nukleotīdu koncentrāciju. Katrs nukleotīds veido vienu [Mg2+] helātu, tāpēc [Mg2+] koncentrācijai vajadzētu pārsniegt kopējo nukleotīda koncentrāciju.

Nukleozīdu trifosfāti (NTP): Kā substrāti NTP ir RNS pamatvienības. NTP koncentrācijai virs 7 mM ir pozitīva ietekme uz mRNS veidošanos.

Spermidīns: Stabilizē DNS-enzīmu kompleksus un stimulē transkripcijas reakcijas; tomēr pārmērīgai koncentrācijai ir inhibējoša iedarbība. Ieteicamā spermidīna koncentrācija ir no 1 līdz 3 mM.

Neorganiskā pirofosfatāze (PPāze): Pievienots IVT reakcijām, lai novērstu neorganisko pirofosfāta jonu (PPi) uzkrāšanos, izvairoties no to helātu veidošanās ar Mg2+ un nodrošinot pietiekamu brīvā Mg2+.

Izmantojot novatorisko tehnoloģiju un IVT mRNS pieredzi, Yaohai Bio-Pharma nodrošina vienas pieturas IVT RNS pakalpojumu, kas ietver secību izstrādi, IVT RNS sagatavošanu (ar m1ψ modifikācijām), RNS ciklizāciju, attīrīšanu, žāvēšanu liofilizācijā, LNP iekapsulēšanu un kvalitātes pārbaudi.

Mēs arī aktīvi meklējam institucionālus vai individuālus globālus partnerus. Mēs piedāvājam konkurētspējīgāko atalgojumu nozarē. Ja jums ir kādi jautājumi, lūdzu, sazinieties ar mums: [email protected]