IVT mRNAの調製

体外転写 (IVT) は、実験室規模でマイクログラムからミリグラムの mRNA を生成できる mRNA 調製の推奨方法です。研究目的で、試薬サプライヤーは中程度の長さ (1000 ～ 4000 ヌクレオチド) の mRNA に適した多用途の IVT 反応システムを開発しました。

本稿では、実験室規模で使用される従来の IVT 反応システムと、超長 mRNA (>9000 ヌクレオチド) に適した IVT 反応システムを含む、mRNA の in vitro 転写 (IVT) についてまとめます。

キットは CleanCap AG による共転写キャッピングを可能にし、m1ψ による免疫原性を低減します。DNase I は残留 DNA を除去します。収量が低い原因としては、混合不良、試薬の酸化、DNA テンプレートの問題などが考えられますが、遠心分離、新しい試薬、コントロール、テンプレートの量/反応時間の調整によって軽減できます。

Yaohai Bio-Pharma は、さまざまな実験やプロジェクトのニーズを満たすために、蛍光タンパク質 (eGFP、mCHERRY)、ルシフェラーゼ、リコンビナーゼ Cre、抗原 OVA などのタンパク質をコードする、さまざまな既製の IVT RNA 製品 (液体/凍結乾燥粉末) と LNP 完成製品を提供しています。

超長鎖mRNA用IVTシステム

従来の IVT は、長すぎる mRNA (>9000 nt) には機能しない可能性があります。IVT コンポーネントの深い理解と合理的な調整が必要です。

DNAテンプレート: 対応するプロモーター配列を持つ線形化プラスミドまたは PCR 産物を RNase フリーの H2O に溶解します。最適な IVT 条件を得るには、40 nM を超える DNA テンプレート濃度が推奨されます。

DTT: 転写中に酵素活性を維持します。最適な酵素活性を得るには、新鮮な DTT を反応バッファーに追加する必要があります。

RNase阻害剤: RNase 活性を阻害し、mRNA の安定性を維持します。

T7 RNAポリメラーゼ: プロモーター配列に応じて、DNA から RNA への転写を触媒します。T7 RNA ポリメラーゼの活性は pH とマグネシウム イオンの影響を受けます。

マグネシウムイオン（Mg2+）： RNAポリメラーゼの補因子。濃度が低すぎると転写効率が低下し、濃度が高すぎるとRNAが分解されます。遊離[Mg2+]はヌクレオチド濃度に基づいて調整する必要があります。各ヌクレオチドは2つの[Mg2+]をキレートするため、[MgXNUMX+]濃度は総ヌクレオチド濃度を超える必要があります。

ヌクレオシド三リン酸（NTP）： 基質として、NTP は RNA の基本単位です。7 mM を超える NTP 濃度は mRNA の生成にプラスの影響を与えます。

スペルミジン: DNA-酵素複合体を安定化し、転写反応を刺激しますが、濃度が高すぎると阻害効果があります。推奨されるスペルミジン濃度は 1 ～ 3 mM です。

無機ピロホスファターゼ（PPase）： IVT 反応に添加して無機ピロリン酸イオン (PPi) の蓄積を防ぎ、Mg2+ とのキレート化を回避し、十分な遊離 Mg2+ を確保します。

Yaohai Bio-Pharma は、先駆的な技術と IVT mRNA の経験を活用し、配列設計、IVT RNA 調製 (m1ψ モッド付き)、RNA 環化、精製、凍結乾燥、LNP カプセル化、品質テストを網羅したワンストップ IVT RNA サービスを提供しています。

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