IVT mRNA準備

体外転写（IVT）は、ラボ規模でマイクログラムからミリグラムまでのmRNAを生成できる好ましい方法です。研究目的のために、試薬メーカーは中程度の長さ（1000-4000塩基）のmRNAに適した多用途のIVT反応システムを開発しました。

この記事では、ラボ規模で使用される従来のIVT反応システムや、超長鎖mRNA（>9000塩基）に適したIVT反応システムを含む、mRNAの体外転写（IVT）について要約します。

キットでは、CleanCap AGを使用した共転写キャピングと、m1ψによる免疫原性の低減が可能です。DNase Iは残留DNAを除去します。低い収量は、混和不足、試薬の酸化、またはDNAテンプレートの問題が原因であることがあり、遠心分離、新鮮な試薬、コントロール、テンプレート量／反応時間の調整によって改善できます。

Yaohai Bio-Pharmaは、さまざまな予製のIVT RNA製品（液状／凍結乾燥粉末）およびLNP最終製品を提供しており、蛍光タンパク質（eGFP、mCHERRY）、ルシフェラーゼ、再構築酵素Cre、抗原OVAなどのタンパク質をエンコードし、異なる実験やプロジェクトのニーズに対応します。

超長mRNA用IVTシステム

従来のIVTは、過剰に長いmRNA（>9000 nt）には適さない場合があります。IVT成分に対する深い理解と合理的な調整が必要です。

DNAテンプレート： 対応するプロモーター配列を持つ線状化されたプラミドまたはPCR産物で、RNaseフリーのH2Oに溶解されています。最適なIVT条件のために、40 nMを超えるDNAテンプレート濃度が推奨されます。

DTT： 転写中の酵素活性を維持します。最適な酵素活性のために、反応バッファーに新鮮なDTTを添加してください。

RNase阻害剤： RNase活性を抑制し、mRNAの安定性を維持します。

T7 RNAポリメラーゼ： プロモーター配列に対応するDNAの転写をRNAに催化します。T7 RNAポリメラーゼの活性はpHとマグネシウムイオンに影響されます。

マグネシウムイオン (Mg2+)： RNAポリメラーゼの補因子です。濃度过低では転写効率が低下し、過剰な濃度ではRNAが分解されます。自由な[Mg2+]はヌクレオチド濃度に基づいて調整する必要があります。各ヌクレオチドは1つの[Mg2+]をキレートするため、[Mg2+]濃度は総ヌクレオチド濃度を超えるべきです。

ヌクレオシド三リン酸 (NTP)： 基質として、NTPはRNAの基本単位です。7 mMを超えるNTP濃度はmRNA生成に良い影響を与えます。

スルミジン： DNA-酵素複合体を安定化し、転写反応を刺激します。しかし、過剰な濃度には抑制作用があります。推奨されるスルミジン濃度は1〜3 mMの間です。

無機ピロリン酸酶 (PPase)： 無機ピロリン酸イオン (PPi) の蓄積を防ぎ、Mg2+ とのキレートを避け、十分な遊離 Mg2+ を確保するために IVT 反応に添加されました。

先駆的な技術と IVT mRNA の経験を活用し、ヤオハイ バイオ ファーマはシーケンス設計、IVT RNA 準備 (m1ψ モディフィケーション付き)、RNA サイクル化、精製、凍結乾燥、LNP 囲み込み、品質試験を網羅するワンストップの IVT RNA サービスを提供します。

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