Svelando i Segreti dell'Estrazione di Plasmidi di Alta Qualità

L'estrazione di plasmidi è fondamentale per i ricercatori. Come vettori genici, i plasmidi sono essenziali nella ricerca sui vaccini e nella terapia genica, dove la qualità conta. I fattori chiave di qualità includono la proporzione superconnessa e il contenuto di endotossine. Le regolamentazioni variano: FDA ≥80%, SMPA ≥85%, NMPA ≥90%, con <5% di DNA lineare/aperto-circolare. I clienti preferiscono spesso ≥95% superconnesso. I livelli di endotossine sono: ricerca (>50 EU/µg), trasfusione (<50 EU/µg) e privo di endotossine (<0.1 EU/µg).

DNA di Plasmidi Superconnessi

I plasmidi derivati da Escherichia coli includono DNA superconnesso (SC), aperto-circolare (OC) e lineare (L). Una alta proporzione SC aumenta l'efficienza di trasfusione ed espressione. Per esempio, un plasmide SC al 85.45% ha una trasfusione 2.5 volte più alta, e un plasmide SC al 93.28% ha un'espressione di HGF 1.8 volte maggiore, confermando la superiorità del DNA SC.

DNA circolare aperto: Quando si rompe una delle due strutture del DNA a doppia elica, la struttura sovramodellata si allenta, formando un plasmide circolare aperto con un volume maggiore che migra più lentamente durante l'elettroforesi e si trova in alto.

DNA lineare: Quando entrambe le catene del DNA plasmidiale si rompono, si forma una struttura lineare, con un volume relativamente minore che migra più velocemente del DNA circolare aperto ma più lentamente del DNA sovramodellato, posizionato al secondo posto.

DNA sovramodellato: Le due eliche si intrecciano, torcendosi in una struttura sovramodellata basata sull'elica del DNA. Ha il volume più piccolo e migra più velocemente durante l'elettroforesi, posizionato in fondo.

Analisi quantitativa della proporzione sovramodellata

I laboratori utilizzano l'elettroforesi su gel di agarosio (AGE) e Gel-Pro Analyzer per giudicare la proporzione sovramodellata tramite immagini elettroforetiche. Un'immagine mostra il 97,539% di DNA SC, mentre un'altra mostra il 63,833% di DNA SC e il 36,167% di DNA OC (il DNA lineare non è visibile).

Il segreto degli endotossini nei plasmidi

L'endotossina è un componente del strato esterno del muro cellulare dei batteri Gram-negativi, rilasciata dopo la morte o lisi batterica, contenente lipopolisaccaride tossico A. Durante l'estrazione del plasmide, l'endotossina entra nella soluzione di lisi, influenzando l'efficienza della trasfessione e attivando risposte immunitarie non specifiche, causando falsi positivi negli esperimenti.

Analisi Quantitativa e Qualitativa dell'Endotossina

Il test con lisato di amebociti di Limulus (LAL) rileva l'endotossina attraverso l'agglutinazione con l'acido 2-chetone-3-deossioottonico (KDO) nel lipopolisaccaride (LPS). È qualitativo e semi-quantitativo, indicando la presenza di endotossina attraverso coagulazione o cambiamento di colore quando mischiato con i campioni.

Yaohai Bio-Pharma offre plasmidi sovraspirale privi di endotossine. Il ricorso a Yaohai migliora l'efficienza di trasfessione e di espressione. I plasmidi consegnati hanno una proporzione ≥95% SC (media 85%±10%) e livelli di endotossina ≤0,1, ≤0,01 o ≤0,005 EU/μg.

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