Svelare i segreti dell'estrazione di plasmidi di alta qualità

L'estrazione di plasmidi è fondamentale per i ricercatori. Come vettori genici, i plasmidi sono essenziali nella ricerca sui vaccini e nella terapia genica, dove la qualità è importante. I principali fattori di qualità includono la proporzione superavvolta e il contenuto di endotossine. Le normative variano: FDA ≥80%, SMPA ≥85%, NMPA ≥90%, con <5% di DNA lineare/circolare aperto. I clienti spesso preferiscono ≥95% superavvolto. I livelli di endotossine sono: ricerca (>50 EU/µg), trasfezione (<50 EU/µg) e senza endotossine (<0.1 EU/µg).

DNA plasmidico superavvolto

I plasmidi di Escherichia coli includono DNA superavvolto (SC), circolare aperto (OC) e lineare (L). Un'elevata proporzione di SC aumenta l'efficienza e l'espressione della trasfezione. Ad esempio, la trasfezione di un plasmide SC all'85.45% è 2.5 volte superiore e l'espressione di HGF di un plasmide SC al 93.28% è 1.8 volte superiore, confermando la superiorità del DNA SC.

DNA circolare aperto: quando un filamento di DNA a doppio filamento si rompe, la struttura superavvolta si allenta, formando un plasmide circolare aperto con un volume maggiore che migra più lentamente durante l'elettroforesi e si posiziona nella parte superiore.

DNA lineare: quando entrambi i filamenti di DNA plasmidico si rompono, si forma una struttura lineare, con un volume relativamente più piccolo che migra più velocemente del DNA circolare aperto ma più lentamente del DNA superavvolto, posizionato per secondo.

DNA superavvolto: due eliche si intrecciano, torcendosi in una struttura superavvolta basata sull'elica del DNA. Ha il volume più piccolo e migra più velocemente durante l'elettroforesi, posizionandosi in basso.

Analisi quantitativa della proporzione superavvolta

I laboratori utilizzano l'elettroforesi su gel di agarosio (AGE) e il Gel-Pro Analyzer per giudicare la proporzione superavvolta tramite immagini di elettroforesi. Un'immagine mostra il 97.539% di DNA SC, mentre un'altra mostra il 63.833% di DNA SC e il 36.167% di DNA OC (DNA lineare non visibile).

Il segreto dell'endotossina nei plasmidi

L'endotossina è un componente dello strato esterno della parete cellulare dei batteri Gram-negativi, rilasciato dopo la morte o la lisi batterica, contenente il lipopolisaccaride A tossico. Durante l'estrazione del plasmide, l'endotossina entra nella soluzione di lisi, influenzando l'efficienza della trasfezione e innescando risposte immunitarie aspecifiche, portando a falsi positivi negli esperimenti.

Analisi quantitativa e qualitativa dell'endotossina

Il test del lisato di amebociti di Limulus (LAL) rileva l'endotossina tramite agglutinazione con acido 2-cheto-3-desossioctonico (KDO) nel lipopolisaccaride (LPS). È qualitativo e semi-quantitativo, indicando la presenza di endotossina tramite coagulazione o cambiamento di colore quando miscelato con i campioni.

Yaohai Bio-Pharma offre plasmidi superavvolti privi di endotossine. L'outsourcing a Yaohai aumenta l'efficienza di trasfezione ed espressione. I plasmidi consegnati hanno una proporzione SC ≥95% (media 85%±10%) e livelli di endotossine ≤0.1, ≤0.01 o ≤0.005 EU/μg.

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