Ottimizzazione dell'integrità cellulare di E. coli per la produzione biofarmaceutica

Nel campo dei biofarmaci, Escherichia coli (E. coli) svolge un ruolo fondamentale come ospite per l'espressione di proteine ricombinanti. L'integrità cellulare dell'E. coli è cruciale per il rendimento, la qualità e i costi di produzione delle proteine. Questa integrità riguarda principalmente la struttura e la funzione della membrana interna (IM) e della membrana esterna (OM).

Yaohai Bio-Pharma ha 15 anni di esperienza in fermentazione E. coli e nell'espressione di proteine ricombinanti. Utilizziamo varie strategie per mantenere un'alta integrità cellulare dell'E. coli, con un rendimento di plasmidi superiore a 1g/L all'interno di un ciclo di coltivazione di 30 ore. Attingendo dall'ampia esperienza nell'espressione microbica, Yaohai Bio-Pharma ha riassunto diverse strategie efficaci per monitorare e migliorare l'integrità cellulare dell'E. coli durante la produzione biotecnologica.

Tecniche per il Monitoraggio dell'Integrità Cellulare di E. coli

Citometria a Flusso: Utilizza coloranti fluorescenti per differenziare gli stati cellulari, come il ioduro di propidio per rilevare la viabilità cellulare e SYTO9 per valutare la permeabilità della MO. Tuttavia, richiede costi elevati per i coloranti e operazioni complesse.

Metodi Colorimetrici: Riflettono la lisi cellulare rilevando il contenuto di DNA, attività enzimatica, ecc., nel sobbrolato, ad esempio utilizzando il kit reagente PicoGreen e test sull'attività della fosfatasi alcalina. Questi metodi, tuttavia, sono ingombranti e richiedono reagenti costosi.

Cromatografia Liquida ad Alta Prestazione: Usata per la rilevazione offline delle concentrazioni di prodotti extracellulari per valutare la perdita di MO. Tuttavia, la sua automazione è complessa e il tempo di analisi è lungo.

Tecniche di Spettroscopia Vibrazionale: Come la spettroscopia infrarossa vicina e media, che hanno potenziali applicazioni ma richiedono di superare interferenze spettrali e sfide nell'analisi dei dati.

Spettroscopia Dielettrica: Valuta l'integrità della membrana misurando l'impedenza di sospensioni cellulari, consentendo un monitoraggio online in tempo reale. Tuttavia, è suscettibile a interferenze e la calibrazione è difficoltosa.

Biosensori: Possono rilevare composti fuoriusciti dagli interni delle cellule o dal periplasma, ma si confrontano con problemi come le difficoltà di rigenerazione del sensore.

Misure di Viscosità e Densità: A basso costo e veloci nell'analisi, ma mancano di seletività e richiedono la considerazione di dati multi-batch per il giudizio.

Fattori che Influiscono sull'Integrità Cellulare

Ingegneria del Ceppo: Altera l'integrità della membrana esterna (OM) attraverso ingegneria genetica, come la mutazione di geni lipoproteici, ma può influenzare la crescita del ceppo.

Stress Indotto: La sovraespressione di proteine ricombinanti causa un fardello metabolico, influenzando la fisiologia cellulare. Pertanto, è necessaria una regolazione ragionevole dei livelli di espressione.

Tasso di Somministrazione del Sostanza Chimica: Sia i tassi eccessivamente alti che quelli troppo bassi influiscono sulla lisi cellulare e sull'integrità della membrana esterna (OM).

Temperatura e Aerazione: Temperature elevate e bassa disponibilità di ossigeno aumentano rispettivamente lo stress espressivo e la fuoriuscita di OM, anche se gli effetti specifici variano.

Osmotici: Usati per rilasciare proteine periplasmatiche ma danneggiano la viabilità cellulare, limitando la loro applicazione.

Conclusione Le future ricerche devono approfondire i meccanismi e le condizioni di riparazione della membrana per controllare con precisione l'integrità della membrana cellulare. Ottimizzare i metodi di monitoraggio e analizzare i fattori influenti potrebbero migliorare la qualità del prodotto, promuovendo così lo sviluppo dell'industria biotecnologica.

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