Ottimizzazione dell'integrità cellulare dell'Escherichia coli per la produzione biofarmaceutica

Nel campo dei biofarmaci, l'Escherichia coli (E. coli) svolge un ruolo fondamentale come ospite per l'espressione di proteine ​​ricombinanti. L'integrità cellulare dell'E. coli è fondamentale per la resa proteica, la qualità e i costi di produzione. Questa integrità riguarda principalmente la struttura e la funzione della membrana interna (IM) e della membrana esterna (OM).

Yaohai Bio-Pharma vanta 15 anni di esperienza nella fermentazione di E. coli e nell'espressione di proteine ​​ricombinanti. Utilizziamo varie strategie per mantenere elevata l'integrità cellulare di E. coli, la resa del plasmide supera 1 g/L in un ciclo di coltivazione di 30 ore. Basandosi sulla vasta esperienza nell'espressione microbica, Yaohai Bio-Pharma ha riassunto diverse strategie efficaci per monitorare e migliorare l'integrità cellulare di E. coli durante la produzione biofarmaceutica.

Tecniche per il monitoraggio dell'integrità cellulare di E. coli

Citometria a flusso: utilizza coloranti fluorescenti per differenziare gli stati cellulari, come lo ioduro di propidio per rilevare la vitalità cellulare e SYTO9 per valutare la permeabilità OM. Tuttavia, richiede l'elevato costo delle colorazioni e operazioni complesse.

Metodi colorimetrici: riflettono la lisi cellulare rilevando il contenuto di DNA, le attività enzimatiche, ecc., nel supernatante, come l'uso del kit di reagenti PicoGreen e dei test di attività della fosfatasi alcalina. Questi metodi, tuttavia, sono ingombranti e richiedono reagenti costosi.

Cromatografia liquida ad alte prestazioni: utilizzata per il rilevamento offline delle concentrazioni di prodotti extracellulari per valutare la perdita di OM. Tuttavia, la sua automazione è complessa e il tempo di analisi è lungo.

Tecniche di spettroscopia vibrazionale: come la spettroscopia nel vicino infrarosso e nel medio infrarosso, che hanno potenziali applicazioni ma richiedono di superare le sfide legate all'interferenza spettrale e all'analisi dei dati.

Spettroscopia dielettrica: valuta l'integrità della membrana misurando l'impedenza delle sospensioni cellulari, consentendo il monitoraggio online in tempo reale. Tuttavia, è suscettibile alle interferenze e la calibrazione è difficile.

Biosensori: possono rilevare composti fuoriusciti dall'interno delle cellule o dal periplasma, ma presentano problemi come difficoltà di rigenerazione dei sensori.

Misurazioni di viscosità e densità: economiche e rapide da analizzare, ma mancano di selettività e richiedono la considerazione di dati multi-lotto per la valutazione.

Fattori che influenzano l'integrità cellulare

Ingegneria dei ceppi: altera l'integrità della matrice extracellulare attraverso l'ingegneria genetica, ad esempio mutando i geni delle lipoproteine, ma può influire sulla crescita del ceppo.

Stress indotto: la sovraespressione di proteine ​​ricombinanti porta a un carico metabolico, che influenza la fisiologia cellulare. Pertanto, è necessaria una ragionevole regolazione dei livelli di espressione.

Tasso di alimentazione del substrato: sia tassi di alimentazione eccessivamente elevati che bassi influiscono sulla lisi cellulare e sull'integrità della matrice extracellulare.

Temperatura e aerazione: le alte temperature e la bassa disponibilità di ossigeno aumentano rispettivamente lo stress da espressione e la perdita di OM, ma gli effetti specifici variano.

Osmotici: utilizzati per rilasciare proteine ​​periplasmatiche, ma danneggiano la vitalità cellulare, limitandone l'applicazione.

Conclusione La ricerca futura deve approfondire i meccanismi e le condizioni di riparazione della membrana per controllare con precisione l'integrità della membrana cellulare. Si prevede che l'ottimizzazione dei metodi di monitoraggio e l'analisi dei fattori influenti miglioreranno la qualità del prodotto, guidando così lo sviluppo dell'industria biofarmaceutica.

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