Preparazione mRNA IVT

La trascrizione in vitro (IVT) è il metodo preferito per preparare mRNA, in grado di produrre microgrammi o milligrammi di mRNA su scala di laboratorio. Per scopi di ricerca, i fornitori di reagenti hanno sviluppato sistemi di reazione IVT versatili adatti per mRNA di lunghezza moderata (1000-4000 nucleotidi).

In questo articolo riassumeremo la trascrizione in vitro (IVT) dell'mRNA, incluso il sistema di reazione IVT convenzionale utilizzato su scala di laboratorio e il sistema di reazione IVT adatto per mRNA ultra-lunghi (>9000 nucleotidi).

I kit consentono il capping co-trascrizionale con CleanCap AG e riducono l'immunogenicità con m1ψ. La DNasi I rimuove il DNA residuo. Una bassa resa può essere dovuta a una scarsa miscelazione, all'ossidazione dei reagenti o a problemi con il modello di DNA, che possono essere mitigati da centrifugazione, reagenti freschi, controlli e regolazione della quantità di modello/tempo di reazione.

Yaohai Bio-Pharma fornisce vari prodotti IVT RNA prefabbricati (liquidi/polvere liofilizzata) e prodotti finiti LNP, che codificano proteine ​​quali proteine ​​fluorescenti (eGFP, mCHERRY), luciferasi, ricombinasi Cre e antigene OVA, per soddisfare diverse esigenze sperimentali o di progetto.

Sistema IVT per mRNA ultra-lunghi

L'IVT convenzionale potrebbe non funzionare per mRNA eccessivamente lunghi (>9000 nt). Sono necessarie una profonda comprensione e un adattamento razionale dei componenti dell'IVT.

Modello di DNA: Plasmidi linearizzati o prodotti PCR con corrispondenti sequenze promotore, disciolti in H2O priva di RNasi. Per condizioni IVT ottimali si raccomanda una concentrazione del modello di DNA superiore a 40 nM.

DIGITALE TERRESTRE: Mantiene l'attività enzimatica durante la trascrizione. DTT fresco dovrebbe essere aggiunto al tampone di reazione per un'attività enzimatica ottimale.

Inibitore della RNasi: Inibisce l'attività della RNasi e mantiene la stabilità dell'mRNA.

T7 RNA polimerasi: Catalizza la trascrizione del DNA in RNA, corrispondente alla sequenza del promotore. L'attività della RNA polimerasi T7 è influenzata dal pH e dagli ioni magnesio.

Ioni di magnesio (Mg2+): Un cofattore per la RNA polimerasi. Concentrazioni troppo basse riducono l'efficienza della trascrizione, mentre concentrazioni troppo alte portano alla degradazione dell'RNA. Il [Mg2+] libero dovrebbe essere regolato in base alla concentrazione di nucleotidi. Ogni nucleotide chela un [Mg2+], quindi la concentrazione di [Mg2+] dovrebbe superare la concentrazione totale di nucleotidi.

Nucleosidi trifosfati (NTP): Come substrati, gli NTP sono le unità di base dell'RNA. Le concentrazioni di NTP superiori a 7 mM hanno un impatto positivo sulla produzione di mRNA.

Spermidina: Stabilizza i complessi DNA-enzima e stimola le reazioni di trascrizione; tuttavia, concentrazioni eccessive hanno effetti inibitori. La concentrazione di spermidina raccomandata è compresa tra 1 e 3 mM.

Pirofosfatasi inorganica (PPasi): Aggiunto alle reazioni IVT per prevenire l'accumulo di ioni pirofosfato inorganici (PPi), evitando la loro chelazione con Mg2+ e garantendo sufficiente Mg2+ libero.

Sfruttando la tecnologia pionieristica e l'esperienza nell'mRNA IVT, Yaohai Bio-Pharma fornisce un servizio IVT RNA completo, che comprende progettazione della sequenza, preparazione dell'RNA IVT (con modifiche m1ψ), ciclizzazione dell'RNA, purificazione, liofilizzazione, incapsulamento LNP e test di qualità.

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