Preparazione di mRNA IVT

La trascrizione in vitro (IVT) è il metodo preferito per preparare mRNA, in grado di produrre microgrammi a milligrammi di mRNA su scala laboratoriale. A scopo di ricerca, i fornitori di reagenti hanno sviluppato sistemi di reazione IVT versatili adatti per mRNA di lunghezza moderata (1000-4000 nucleotidi).

In questo articolo, riassumeremo la trascrizione in vitro (IVT) di mRNA, inclusi il sistema di reazione IVT convenzionale utilizzato su scala laboratoriale e il sistema di reazione IVT adatto per mRNA ultra-lungo (>9000 nucleotidi).

I kit consentono il cappatura co-trascrizionale con CleanCap AG e riducono l'immunogenicità con m1ψ. La DNasi I rimuove il DNA residuo. Un basso rendimento può essere causato da miscelazione insufficiente, ossidazione dei reagenti o problemi del DNA template, che possono essere mitigati mediante centrifugazione, reagenti freschi, controlli e regolando la quantità di template/tempo di reazione.

Yaohai Bio-Pharma fornisce vari prodotti IVT RNA prefabbricati (liquidi/polvere liofilizzata) e prodotti finiti LNP, che codificano proteine come proteine fluorescenti (eGFP, mCHERRY), luciferasi, ricombinasi Cre e antigene OVA, per soddisfare diverse esigenze sperimentali o di progetto.

Sistema IVT per mRNA ultra-lungo

L'IVT convenzionale potrebbe non funzionare per mRNA eccessivamente lunghi (>9000 nt). È necessario un approfondito comprendere e un'adeguata regolazione dei componenti dell'IVT.

Template DNA: Plasmidi linearizzati o prodotti PCR con sequenze promotori corrispondenti, sciolte in H2O priva di RNasi. Si consiglia una concentrazione del template DNA superiore a 40 nM per condizioni ottimali di IVT.

DTT: Mantiene l'attività enzimatica durante la trascrizione. Si dovrebbe aggiungere DTT fresco al tampone di reazione per garantire un'attività enzimatica ottimale.

Inibitore di RNasi: Inibisce l'attività delle RNasi e mantiene la stabilità dell'mRNA.

Polimerasi RNA T7: Catalizza la trascrizione del DNA in RNA, corrispondente alla sequenza del promotore. L'attività della polimerasi RNA T7 è influenzata dal pH e dagli ioni magnesio.

Ioni Magnesio (Mg2+): Un cofattore per la polimerasi RNA. Concentrazioni troppo basse riducono l'efficienza della trascrizione, mentre concentrazioni troppo alte portano alla degradazione dell'RNA. Il [Mg2+] libero dovrebbe essere regolato in base alla concentrazione di nucleotidi. Ogni nucleotide chelante un [Mg2+], quindi la concentrazione di [Mg2+] deve superare la concentrazione totale di nucleotidi.

Nucleosidi Trifosfati (NTP): Come substrati, i NTP sono le unità base dell'RNA. Le concentrazioni di NTP superiori a 7 mM hanno un impatto positivo sulla produzione di mRNA.

Spermidina: Stabilizza i complessi DNA-enzima e stimola le reazioni di trascrizione; tuttavia, concentrazioni eccessive hanno effetti inibitori. La concentrazione consigliata di spermidina è compresa tra 1 e 3 mM.

Pirofosfatasi Inorganica (PPase): Aggiunto alle reazioni IVT per prevenire l'accumulo di ioni pirrofosfato inorganico (PPi), evitando la loro chelazione con Mg2+ e garantendo una quantità sufficiente di Mg2+ libero.

Utilizzando una tecnologia pioniera ed esperienza in mRNA IVT, Yaohai Bio-Pharma offre un servizio completo di RNA IVT, che include il design delle sequenze, la preparazione di RNA IVT (con modifiche m1ψ), la ciclizzazione del RNA, la purificazione, la liofilizzazione, l'incapsulamento LNP e i test di qualità.

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