L'utilizzo del Potere della Strategia di Fermentazione Fed-batch

Pichia pastoris è ampiamente utilizzata nella produzione di vari proteine eterologhe. La tecnologia di Fermentazione ad Alta Densità Celulare (HCDF), implementata attraverso l'alimentazione Fed-Batch, ha raggiunto con successo la produzione su larga scala di bi farmaci e enzimi industriali. In ambienti controllati con precisione, l'utilizzo della tecnologia HCDF può ottenere proteine ricombinanti ad alto rendimento, alta attività e a basso costo.

Ricerche recenti indicano che attraverso strategie HCDF si stanno compiendo sforzi per aumentare la produzione e l'attività delle proteine eterologhe in Pichia pastoris. La tecnologia HCDF consente di raggiungere facilmente cluster cellulari ad alto livello in ambienti definiti, consentendo così di ottenere abbondanti proteine ricombinanti con un'attività migliorata e costi ridotti tramite HCDF. Tuttavia, selezionare la strategia HCDF appropriata per ottimizzare l'espressione ad alto livello di specifiche proteine in Pichia pastoris rimane una sfida.

Fermentazione ad Alta Densità Celulare (HCDF)

Pichia pastoris eccelle nella produzione di proteine eterologhe, preferita per l'HCDF in bioreattori automatizzati. L'HCDF ha 3 fasi: batch di glicerolo, alimentazione e induzione con metanolo. Yaohai Bio-Pharma si vanta di avere più di un decennio di esperienza nella fermentazione microbica e ha servito oltre 400 progetti. L'azienda possiede una vasta esperienza e una tecnologia ben sviluppata, il che le permette di utilizzare varie strategie HCDF per migliorare l'efficienza della produzione di proteine.

Il metanolo funge da induttore di AOX1 e da sorgente di carbonio, ma la sua concentrazione deve essere controllata per evitare la tossicità. Valutare diverse strategie di somministrazione di metanolo è fondamentale per ottimizzare la crescita di Pichia pastoris e l'espressione di proteine.

Strategia di induzione con metanolo

Nella strategia di induzione con metanolo in batch alimentati HCDF, le strategie di induzione basate sullo stato includono un insieme di metodologie di controllo che regolano l'aggiunta supplementare di metanolo attraverso il controllo online/offline o avanti/indietro. Tra le strategie di induzione statistiche, le principali includono μ-stat, Dissolved Oxygen (DO)-stat, metanolo-stat e biomass-stat.

1.1 μ-stat

la strategia μ-stat mantiene costante la biomassa controllando μ, aiutando la riproducibilità e lo studio dell'effetto di μ sull'espressione proteica. Tuttavia, manca di un controllo diretto del metanolo e del DO, rischiando accumulo e generazione di ROS.

1.2 DO-stat

La strategia DO-stat regola indirettamente l'alimentazione di metanolo controllando l'ossigeno dissolto per mantenere l'ossigenazione, ma non fissa la concentrazione di metanolo e il tasso di crescita, il che può influenzare lo studio dell'espressione proteica. L'ossigenazione rappresenta una sfida nella fermentazione aerobica, e sebbene l'integrazione di ossigeno puro possa essere costosa e tossica, l'aumento della pressione è un approccio più economico che può anche migliorare l'attività proteica.

1.3 Methanol-stat

Un controllo inadeguato della concentrazione di metanolo impone limiti a entrambe le strategie μ-stat e DO-stat. Le strategie statistiche di metanolo, che operano in modalità on/off, sono soggette a fluttuazioni e mancano di precisione. In contrasto, i controller PID offrono una regolazione più precisa della concentrazione di metanolo, migliorando l'efficacia complessiva della fermentazione.

1.4 Biomass-stat

La strategia biomass-stat definisce la relazione tra biomassa e alimentazione di metanolo, ottimizzando il tasso di alimentazione di metanolo per migliorare il rendimento proteico. Il monitoraggio online della biomassa è più pratico, con la citometria a flusso come metodo preferito. A una scala di 1000L, l'ottimizzazione del tasso di alimentazione di metanolo migliora significativamente l'attività enzimatica, il rendimento e la produttività, superando la fermentazione in flacone.

Strategia di co-alimentazione

Il glicerolo, come inibitore del promotore AOX1, deve essere completamente consumato prima dell'induzione con metanolo per evitare di sopprimere la produzione di proteine. I co-sostegni possono migliorare l'attività enzimatica, ma un eccesso di glicerolo può danneggiare la crescita e l'espressione. Sorbitolo, acido ascorbico, mannitolo e altri possono sostituire il glicerolo, riducendo la proteolisi e il tempo di coltivazione e migliorando l'espressione proteica.

Il banco di ceppi richiede l'adozione di metodi di conservazione appropriati e il posizionamento in un ambiente adatto per mantenere la stabilità delle caratteristiche dei ceppi. Yaohai Bio-Pharma può soddisfare i requisiti per la conservazione con scorte di glicerolo (tramite freezer ad ultra-bassa temperatura o azoto liquido) e la conservazione per lyophilizzazione di lieviti e E. coli.

Strategia indotta da restrizioni

In Pichia pastoris, condizioni restrittive come basso DO, concentrazione di metanolo e limite di ossigeno aumentano l'espressione di proteine ricombinanti. Le condizioni a ossigeno limitato attivano il promotore AOX1 tramite l'accumulo di metanolo, aumentando l'output di proteine mentre riducono il calore. L'induzione a bassa temperatura migliora il rendimento, l'attività, la stabilità e la viabilità cellulare, ma aggiunge costi di raffreddamento. Il pH e la limitazione di azoto aiutano anche l'espressione, richiedendo cautela per evitare problemi operativi. La limitazione di azoto migliora notevolmente la produttività specifica delle proteine.

Yaohai Bio-Pharma sta cercando attivamente partner istituzionali o individuali a livello globale e offre la compensazione più competitiva del settore. Se hai domande, non esitare a contattarci: [email protected]