Sfruttare la potenza della strategia di fermentazione fed-batch

Pichia pastoris è ampiamente utilizzata nella produzione di varie proteine ​​eterologhe. La tecnologia High-Cell-Density Fermentation (HCDF), implementata tramite alimentazione Fed-Batch, ha raggiunto con successo la produzione su larga scala di biofarmaci ed enzimi industriali. In terreni controllati con precisione, l'utilizzo della tecnologia HCDF può ottenere proteine ​​ricombinanti ad alta resa, alta attività e convenienti.

Ricerche recenti indicano che attraverso strategie HCDF, si stanno facendo sforzi per aumentare la produzione e l'attività di proteine ​​eterologhe in Pichia pastoris. La tecnologia HCDF consente di ottenere senza sforzo cluster cellulari di alto livello in terreni definiti, consentendo così l'acquisizione di abbondanti proteine ​​ricombinanti con attività potenziata e costi ridotti tramite HCDF. Tuttavia, selezionare la strategia HCDF appropriata per ottimizzare l'espressione di alto livello di proteine ​​specifiche in Pichia pastoris rimane una sfida.

Fermentazione ad alta densità cellulare (HCDF)

Pichia pastoris eccelle nella produzione di proteine ​​eterologhe, preferita per HCDF in bioreattori automatizzati. HCDF ha 3 fasi: batch di glicerolo, alimentazione e induzione di metanolo. Yaohai Bio-Pharma vanta oltre un decennio di esperienza nella fermentazione microbica e ha servito oltre 400 progetti. L'azienda possiede una vasta competenza e una tecnologia ben sviluppata, che le consente di utilizzare varie strategie HCDF per migliorare l'efficienza della produzione di proteine.

Il metanolo funge sia da induttore di AOX1 sia da fonte di carbonio, ma la sua concentrazione deve essere controllata per prevenire la tossicità. Valutare diverse strategie di alimentazione del metanolo è fondamentale per ottimizzare la crescita di Pichia pastoris e l'espressione proteica

Strategia di induzione del metanolo

Nella strategia di induzione del metanolo HCDF fed-batch, le strategie di induzione basate sullo stato comprendono un set di metodologie di controllo che regolano l'aggiunta supplementare di metanolo tramite controllo online/offline o forward/reverse. Tra le strategie di induzione statistica, le principali includono μ-stat, Dissolved Oxygen (DO)-stat, methanol-stat e biomass-stat.

1.1 μ-stato

La strategia μ-stat mantiene la biomassa stabile controllando μ, favorendo la riproducibilità e studiando l'effetto di μ sull'espressione proteica. Tuttavia, manca il controllo diretto di metanolo e DO, rischiando l'accumulo e la generazione di ROS.

1.2 DO-stat

La strategia DO-stat regola indirettamente l'alimentazione di metanolo controllando l'ossigeno disciolto per mantenere l'ossigenazione, ma non fissa la concentrazione di metanolo e il tasso di crescita, il che può influenzare lo studio dell'espressione proteica. L'ossigenazione rappresenta una sfida nella fermentazione aerobica e, mentre l'integrazione di ossigeno puro può essere costosa e tossica, l'aumento della pressione è un approccio più economico che può anche migliorare l'attività proteica.

1.3 Metanolo-stat

Un controllo inadeguato della concentrazione di metanolo pone delle limitazioni sia alle strategie μ-stat che DO-stat. Le strategie statistiche del metanolo, che operano in modalità on/off, sono soggette a fluttuazioni e mancano di precisione. Al contrario, i controller PID offrono una regolazione più precisa della concentrazione di metanolo, migliorando l'efficacia complessiva della fermentazione.

1.4 Biomassa-stat

La strategia biomass-stat definisce la relazione tra biomassa e alimentazione di metanolo, ottimizzando il tasso di alimentazione di metanolo per migliorare la resa proteica. Il monitoraggio online della biomassa è più pratico, con la citometria a flusso come metodo preferito. Su una scala di 1000 L, l'ottimizzazione del tasso di alimentazione di metanolo migliora significativamente l'attività enzimatica, la resa e la produttività, superando la fermentazione in fiasca.

Strategia di co-alimentazione

Il glicerolo, in quanto inibitore del promotore AOX1, deve essere completamente consumato prima dell'induzione con metanolo per evitare di sopprimere la produzione proteica. I co-substrati possono migliorare l'attività enzimatica, ma un eccesso di glicerolo può danneggiare la crescita e l'espressione. Sorbitolo, acido ascorbico, mannitolo e altri possono sostituire il glicerolo, riducendo la proteolisi e il tempo di coltivazione e migliorando l'espressione proteica.

La banca dei ceppi richiede l'adozione di metodi di conservazione appropriati e il posizionamento in un ambiente adatto per mantenere la stabilità delle caratteristiche del ceppo. Yaohai Bio-Pharma può soddisfare i requisiti per la conservazione dello stock di glicerolo (tramite congelatori a temperatura ultra-bassa o azoto liquido) e la conservazione tramite liofilizzazione di lievito ed E. coli.

Strategia indotta dalla restrizione

In Pichia pastoris, condizioni restrittive come bassa DO, concentrazione di metanolo e limite di ossigeno potenziano l'espressione proteica ricombinante. Le condizioni limitate dall'ossigeno attivano il promotore AOX1 tramite accumulo di metanolo, aumentando la produzione di proteine ​​e riducendo il calore. L'induzione a bassa temperatura migliora la resa, l'attività, la stabilità e la vitalità cellulare, ma aggiunge costi di raffreddamento. Anche la limitazione di pH e azoto favorisce l'espressione, richiedendo cautela per evitare problemi operativi. La limitazione di azoto migliora notevolmente la produttività proteica specifica.

Yaohai Bio-Pharma è anche attivamente alla ricerca di partner globali istituzionali o individuali e offre la retribuzione più competitiva del settore. Se avete domande, non esitate a contattarci: [email protected]