Metodi di modifica dell'RNA reporter di supporto

Quando si sceglie quale metodo di modifica dell'mRNA reporter sia preferibile, non esiste una risposta definitiva poiché ogni metodo e gene reporter ha i suoi vantaggi e scenari applicabili. Ecco alcuni metodi comuni di modifica dell'mRNA e geni reporter, insieme alle loro caratteristiche e idoneità.

Metodi di modifica dell'mRNA

Metilazione:

1. m6A: Associato alla stabilità dell'mRNA, allo splicing, alla traduzione e all'elaborazione del miRNA. Le sfide di rilevamento includono la selezione e la localizzazione degli anticorpi.
2. Tappo da 5' Nm: Migliora la stabilità, lo splicing, la poliadenilazione e l'esportazione nucleare. Aiuta a distinguere l'auto-RNA dall'RNA estraneo.
3. Pseudouridilazione: Altera i codoni, aumenta la stabilità e risponde allo stress. Catalizzato dalle pseudouridine sintasi.

Introduzioni di nucleotidi non naturali:

1. Introdotto durante la trascrizione con una strategia di modifica chimica duale. Migliora la stabilità, l'efficienza e l'espressione proteica.

Geni giornalistici

1. Gene della proteina fluorescente verde (GFP): Vantaggi: Facile da rilevare, proprietà di fluorescenza stabili, non tossico per le cellule, adatto per l'imaging di cellule vive. Svantaggi: Intensità di fluorescenza limitata.
2. Proteina fluorescente verde potenziata (eGFP): Vantaggi: oltre 6 volte più luminoso della GFP di tipo selvatico, il che lo rende più adatto come gene reporter per studiare l'espressione genica, la regolazione, la differenziazione cellulare, la localizzazione e il trasporto delle proteine ​​all'interno degli organismi.
3. Proteine ​​fluorescenti rosse (ad esempio, mCherry): Vantaggi: lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione più lunghe, con conseguente minore background durante l'imaging intracellulare, eccellente luminosità della fluorescenza e fotostabilità e minore tossicità cellulare. Svantaggi: potrebbe non essere utilizzato comunemente come GFP in determinate condizioni sperimentali.
4. Luciferasi della lucciola: Vantaggi: in presenza di ATP, ioni di magnesio e ossigeno, può catalizzare l'ossidazione della luciferina in ossiluciferina, emettendo bioluminescenza. È adatto per l'uso come controllo per studiare l'efficienza di traduzione dei geni target nelle cellule dei mammiferi, la vitalità cellulare e i test di imaging in vivo.

Conclusione

Quando si sceglie quale metodo di modifica dell'mRNA reporter è preferibile, dipende da obiettivi sperimentali specifici, background di ricerca e condizioni sperimentali. Ad esempio, se è richiesta un'elevata sensibilità, eGFP potrebbe essere una scelta migliore. Se è necessaria l'imaging a lunghezze d'onda maggiori per ridurre l'interferenza di fondo, proteine ​​fluorescenti rosse come mCherry potrebbero essere più adatte. Inoltre, in base alle specifiche esigenze di modifica dell'mRNA (ad esempio, miglioramento della stabilità, miglioramento dell'efficienza della traduzione), è possibile selezionare il metodo di modifica corrispondente.

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