Procédé de fabrication de l'ARNm eGFP

La production d'ARNm d'eGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein) implique une série de techniques de biologie moléculaire pour générer une molécule d'ARN fonctionnelle qui code pour l'expression de l'eGFP. Dans le domaine de l'ARNm d'eGFP, Yaohai Bio-Pharma a accumulé une vaste expérience pour répondre aux besoins spécifiques des clients. En nous appuyant sur notre expérience, nous avons synthétisé le processus de production de l'ARNm EGFP.

1. Clonage du gène eGFP : Il s'agit d'obtenir la séquence de gène codant pour l'eGFP. Ce gène est généralement cloné à partir d'un vecteur plasmidique préexistant ou synthétisé artificiellement en se basant sur la séquence nucléotidique connue. Le gène cloné est ensuite vérifié par séquençage pour assurer son exactitude.
2. Optimisation du gène pour l'expression : Pour une expression optimale dans le système cible (par exemple, des cellules mammifères, des bactéries ou des systèmes de transcription in vitro), le gène eGFP peut subir une optimisation des codons. Cela implique le remplacement des codons rares dans la séquence originale par des codons utilisés plus fréquemment dans l'organisme hôte, augmentant ainsi les chances d'une traduction efficace.
3. In vitro Préparation du Modèle de Transcription : Une fois que le gène optimisé est prêt, il est incorporé dans un vecteur approprié, souvent un plasmide, qui contient les éléments régulateurs nécessaires à la transcription (par exemple, une séquence promoteur). Ce plasmide sert de modèle pour la transcription in vitro.
4. In vitro Transcription : À l'aide du plasmide préparé, la transcription in vitro est réalisée pour synthétiser l'ARNm eGFP. Ce processus implique l'utilisation d'enzymes polymérase ARN, qui reconnaissent la séquence promoteur et initient la transcription, produisant une chaîne d'ARN complémentaire au modèle d'ADN. En fonction de l'application souhaitée, l'ARNm peut être chapté, polyadénylé et/ou modifié pour améliorer sa stabilité et son efficacité de traduction.
5. Purification et Contrôle Qualité : L'ARNm eGFP synthétisé est ensuite purifié pour éliminer tout contaminant, y compris l'ADN, les protéines et les nucléotides libres. Les méthodes de purification peuvent inclure l'électrophorèse sur gel, la chromatographie en colonne ou la séparation à base de perles. Après purification, l'ARNm est analysé pour sa qualité, y compris sa concentration, sa pureté et son intégrité, en utilisant des techniques telles que la spectrophotométrie UV-Vis et l'électrophorèse sur gel.
6. Stockage et Livraison : L'ARNm eGFP purifié est généralement stocké à basse température pour maintenir sa stabilité. Pour une utilisation expérimentale, l'ARNm peut être introduit dans les cellules par diverses méthodes, y compris l'électroporation, la lipofection ou des vecteurs viraux, en fonction de l'application spécifique et du type de cellule cible.
7. Expression et Vérification : Une fois à l'intérieur de la cellule, l'ARNm eGFP est traduit en protéine fluorescente verte renforcée, qui peut être visualisée à l'aide d'une microscopie fluorescente. Cela permet de vérifier le succès de la production, de la livraison et de l'expression de l'ARNm.

En résumé, la production de l'ARNm eGFP implique le clonage du gène, son optimisation pour l'expression, la préparation d'un modèle de transcription in vitro, la réalisation de la réaction de transcription, la purification de l'ARNm résultant, et enfin sa livraison dans les cellules pour l'expression et la vérification.

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