Procédé de fabrication de l'ARNm eGFP

La production d'ARNm eGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein) implique une série de techniques de biologie moléculaire pour générer une molécule d'ARN fonctionnelle qui code pour l'expression de l'eGFP. Dans le domaine de l'ARNm eGFP, Yaohai Bio-Pharma a accumulé une vaste expérience pour répondre aux besoins spécifiques des clients. En tirant parti de notre expérience, nous avons synthétisé le flux de processus pour la production d'ARNm EGFP.

1. Clonage du gène eGFP:Il s'agit d'obtenir la séquence du gène codant pour l'eGFP. Ce gène est généralement cloné à partir d'un vecteur plasmidique préexistant ou synthétisé artificiellement sur la base de la séquence nucléotidique connue. Le gène cloné est ensuite vérifié par séquençage pour garantir son exactitude.
2. Optimisation des gènes pour l'expression:Pour une expression optimale dans le système cible (par exemple, les cellules de mammifères, les bactéries ou les systèmes de transcription in vitro), le gène eGFP peut subir une optimisation des codons. Cela implique de remplacer les codons rares de la séquence d'origine par des codons plus fréquemment utilisés dans l'organisme hôte, augmentant ainsi les chances d'une traduction efficace.
3. In vitro Préparation du modèle de transcription:Une fois le gène optimisé prêt, il est incorporé dans un vecteur approprié, souvent un plasmide, qui contient les éléments régulateurs nécessaires à la transcription (par exemple, une séquence promotrice). Ce plasmide sert de modèle pour la transcription in vitro.
4. In vitro Transcription:À l'aide du modèle plasmidique préparé, une transcription in vitro est réalisée pour synthétiser l'ARNm eGFP. Ce processus implique l'utilisation d'enzymes ARN polymérase, qui reconnaissent la séquence promotrice et initient la transcription, produisant un brin d'ARN complémentaire au modèle d'ADN. Selon l'application souhaitée, l'ARNm peut être coiffé, polyadénylé et/ou modifié pour améliorer la stabilité et l'efficacité de la traduction.
5. Purification et contrôle qualité:L'ARNm eGFP synthétisé est ensuite purifié pour éliminer tous les contaminants, notamment l'ADN, les protéines et les nucléotides libres. Les méthodes de purification peuvent inclure l'électrophorèse sur gel, la chromatographie sur colonne ou la séparation à base de billes. Après purification, l'ARNm est analysé pour en déterminer la qualité, notamment la concentration, la pureté et l'intégrité, à l'aide de techniques telles que la spectrophotométrie UV-Vis et l'électrophorèse sur gel.
6. Stockage et livraison:L'ARNm eGFP purifié est généralement stocké à basse température pour maintenir sa stabilité. Pour une utilisation expérimentale, l'ARNm peut être délivré dans les cellules à l'aide de diverses méthodes, notamment l'électroporation, la lipofection ou des vecteurs viraux, en fonction de l'application spécifique et du type de cellule cible.
7. Expression et Vérification:Une fois à l'intérieur de la cellule, l'ARNm eGFP est traduit en protéine fluorescente verte améliorée, qui peut être visualisée à l'aide d'un microscope à fluorescence. Cela permet de vérifier la production, la distribution et l'expression réussies de l'ARNm.

En résumé, la production d’ARNm eGFP implique le clonage du gène, son optimisation pour l’expression, la préparation d’un modèle de transcription in vitro, la réalisation de la réaction de transcription, la purification de l’ARNm résultant et enfin son administration dans les cellules pour expression et vérification.

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