Nouvelles Techniques d'Assemblage pour la Synthèse Génétique à Grande Échelle

La technologie d'assemblage pour synthétiser des fragments d'ADN de grande taille à partir de zéro est la pierre angulaire de la synthèse de gènes, incluant des méthodes telles que BioBrick™, TAR, BglBrick, Golden Gate, Gibson assembly, CPEC et Overlap PCR. En raison des limites de la technologie actuelle pour synthétiser précisément de l'ADN de longueur génique en une seule étape, il est nécessaire de combiner des techniques d'assemblage in vitro et in vivo afin d'assembler des fragments d'oligonucléotides synthétisés par segments en fragments d'ADN longs.

Techniques d'assemblage in vitro

Ils sont classifiés en diverses méthodes en fonction de la taille des fragments et des caractéristiques des séquences, avec un besoin commun d'utiliser des enzymes outils. Le PCR par recouvrement, basé sur la méthode de polymérase ADN, est simple et rapide à exécuter. Les méthodes BioBrick et BglBrick, qui reposent sur les isoschizomères, permettent une assemblée standardisée, bien que la méthode BioBrick ne soit pas adaptée pour les protéines de fusion. La méthode de clonage Golden Gate, basée sur les enzymes de restriction de type IIS, permet une ligature efficace sans couture de plusieurs fragments. La méthode d'assemblage Gibson, qui utilise une combinaison de plusieurs enzymes outils, permet une ligature sans couture avec des tailles de fragment atteignant plusieurs centaines de kb. La conception standardisée des composants ADN améliore le taux d'utilisation des fragments existants.

Techniques d'assemblage in vivo

Bien que in vitro la taille des fragments assemblés peut atteindre plusieurs centaines de kb, mais le rendement est souvent insuffisant, nécessitant une amplification à l'aide d'organismes tels que Escherichia coli. Dans l'assemblage de fragments dépassant 20 kb, des systèmes recombinants au sein d'organismes sont souvent utilisés, y compris Bacillus subtilis, la levure et des bactéries ingénierées. La levure, en tant qu'hôte couramment utilisé, est reconnue depuis de nombreuses années pour sa capacité efficace de recombinaison homologue. Elle peut être utilisée pour assembler des chromosomes artificiels atteignant plusieurs mégabases (Mb) de longueur. De plus, Saccharomyces cerevisiae présente une tolérance extraordinaire à la longueur des chromosomes, offrant une base théorique pour l'utilisation de la levure afin de construire des chromosomes ultra-longs chez les organismes supérieurs.

APPLICATIONS

Yaohai Bio-Pharma utilise principalement deux méthodes d'assemblage pour la synthèse de gènes : l'assemblage par ligase et l'assemblage par polymérase. La méthode d'assemblage par ligase relie des fragments d'oligonucléotides 5'-phosphorylés, qui se chevauchent et s'hybrident, en ADN double brin à l'aide d'une ligase ADN. La méthode d'assemblage par polymérase utilise une polymérase ADN pour étendre les fragments d'oligonucléotides chevauchants par hybridation, obtenant un mélange de différentes longueurs, puis amplifiant les fragments complets assemblés avec succès à l'aide d' amorces. Yaohai peut aider les clients à satisfaire des exigences spécifiques en synthèse de gènes.

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