Techniques d'assemblage innovantes pour la synthèse de gènes à grande échelle

La technologie d'assemblage permettant de synthétiser de gros fragments d'ADN à partir de zéro est la pierre angulaire de la synthèse génétique, et englobe des méthodes telles que BioBrick™, TAR, BglBrick, Golden Gate, Gibson assembly, CPEC et Overlap PCR. En raison des limites de la technologie actuelle pour synthétiser avec précision de l'ADN de la longueur d'un gène en une seule étape, il est nécessaire de combiner des techniques d'assemblage in vitro et in vivo pour assembler des fragments d'oligonucléotides synthétisés en segments en de longs fragments d'ADN.

Techniques d'assemblage in vitro

Elles sont classées en plusieurs méthodes en fonction de la taille des fragments et des caractéristiques de la séquence, avec une exigence commune pour l'utilisation d'enzymes outils. La PCR par chevauchement, basée sur la méthode de l'ADN polymérase, est simple et rapide à utiliser. Les méthodes BioBrick et BglBrick, qui s'appuient sur des isoschizomères, permettent un assemblage standardisé, bien que la méthode BioBrick ne soit pas adaptée aux protéines de fusion. La méthode de clonage Golden Gate, basée sur des enzymes de restriction de type IIS, permet une ligature efficace et transparente de plusieurs fragments. La méthode d'assemblage Gibson, qui utilise une combinaison de plusieurs enzymes outils, permet une ligature transparente avec des tailles de fragments atteignant plusieurs centaines de kb. La conception standardisée des composants de l'ADN améliore le taux d'utilisation des fragments existants.

Techniques d'assemblage in vivo

Bien que in vitro les fragments assemblés peuvent atteindre plusieurs centaines de kb de taille, le rendement est souvent insuffisant, nécessitant une amplification à l'aide d'organismes tels que Escherichia coli. Pour assembler des fragments dépassant 20 kb, on utilise souvent des systèmes recombinants au sein d'organismes, notamment Bacillus subtilis, des levures et des bactéries génétiquement modifiées. La levure, en tant qu'hôte couramment utilisé, est reconnue depuis de nombreuses années pour sa capacité de recombinaison homologue efficace. Elle peut être utilisée pour assembler des chromosomes artificiels jusqu'à plusieurs mégabases (Mb) de longueur. De plus, Saccharomyces cerevisiae présente une tolérance extraordinaire à la longueur des chromosomes, ce qui fournit une base théorique pour l'utilisation de la levure pour construire des chromosomes ultra-longs dans des organismes supérieurs.

Applications

Yaohai Bio-Pharma utilise principalement deux méthodes d'assemblage pour la synthèse des gènes : l'assemblage par ligase et l'assemblage par ADN polymérase. La méthode d'assemblage par ligase relie les fragments d'oligonucléotides 5'-phosphorylés superposés et hybridés en ADN double brin à l'aide de l'ADN ligase. La méthode d'assemblage par polymérase utilise l'ADN polymérase pour étendre les fragments d'oligonucléotides superposés par hybridation, obtenir un mélange de différentes longueurs et enfin amplifier les fragments pleine longueur assemblés avec succès à l'aide d'amorces. Yaohai peut aider ses clients à satisfaire des exigences spécifiques en matière de synthèse des gènes.

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