Utiliser le pouvoir de la stratégie de fermentation par lots alimentés

Pichia pastoris est largement utilisé dans la production de diverses protéines hétérologues. La technologie de fermentation à haute densité cellulaire (HCDF), mise en œuvre par l'alimentation en mode Fed-Batch, a réussi à produire à grande échelle des biopharmaceutiques et enzymes industrielles. Dans des milieux contrôlés avec précision, l'utilisation de la technologie HCDF permet d'obtenir des protéines recombinantes à haut rendement, haute activité et à coût réduit.

Les recherches récentes indiquent qu'à travers des stratégies HCDF, des efforts sont déployés pour augmenter la production et l'activité des protéines hétérologues chez Pichia pastoris. La technologie HCDF permet d'atteindre facilement des concentrations élevées de cellules dans des milieux définis, permettant ainsi d'obtenir des quantités abondantes de protéines recombinantes avec une activité améliorée et des coûts réduits grâce à HCDF. Cependant, sélectionner la stratégie HCDF appropriée pour optimiser l'expression à haut niveau de protéines spécifiques chez Pichia pastoris reste un défi.

Fermentation à haute densité cellulaire (HCDF)

Pichia pastoris excelle dans la production de protéines hétérologues, privilégiée pour le HCDF dans les bioréacteurs automatisés. Le HCDF comporte 3 étapes : lot de glycérine, alimentation et induction au méthanol. Yaohai Bio-Pharma bénéficie d'une décennie d'expérience en fermentation microbienne et a travaillé sur plus de 400 projets. L'entreprise possède une expertise approfondie et une technologie bien développée, ce qui lui permet d'utiliser différentes stratégies HCDF pour améliorer l'efficacité de la production de protéines.

Le méthanol sert à la fois d'inducteur de AOX1 et de source de carbone, mais sa concentration doit être contrôlée pour éviter la toxicité. Évaluer différentes stratégies d'alimentation en méthanol est crucial pour optimiser la croissance de Pichia pastoris et l'expression des protéines.

Stratégie d'induction au méthanol

Dans la stratégie d'induction au méthanol en culture HCDF par lots alimentés, les stratégies d'induction basées sur l'état comprennent un ensemble de méthodologies de contrôle qui régulent l'ajout supplémentaire de méthanol via des contrôles en ligne/hors ligne ou avant/arrière. Parmi les stratégies d'induction statistiques, les principales incluent μ-stat, Dissolved Oxygen (DO)-stat, methanol-stat et biomass-stat.

1.1 μ-stat

la stratégie μ-stat maintient la biomasse stable en contrôlant μ, aidant à la reproductibilité et à l'étude de l'effet de μ sur l'expression protéique. Cependant, elle ne contrôle pas directement le méthanol et le DO, risquant ainsi une accumulation et la génération de ROS.

1.2 DO-stat

La stratégie DO-stat régule indirectement l'alimentation en méthanol en contrôlant l'oxygène dissous pour maintenir l'oxygénation, mais elle n'ajuste pas la concentration de méthanol et le taux de croissance, ce qui peut affecter l'étude de l'expression des protéines. L'oxygénation représente un défi dans la fermentation aérobie, et bien que l'ajout d'oxygène pur puisse être coûteux et toxique, l'amélioration de la pression est une approche plus économique qui peut également améliorer l'activité des protéines.

1.3 Méthanol-stat

Un contrôle insuffisant de la concentration de méthanol présente des limites pour les stratégies μ-stat et DO-stat. Les stratégies statistiques au méthanol, qui fonctionnent en mode on/off, sont sujettes à des fluctuations et manquent de précision. En revanche, les contrôleurs PID offrent une régulation plus précise de la concentration de méthanol, améliorant ainsi l'efficacité globale de la fermentation.

1.4 Biomasse-stat

La stratégie biomass-stat définit la relation entre la biomasse et l'alimentation en méthanol, en optimisant le taux d'alimentation en méthanol pour améliorer le rendement en protéines. Le suivi en ligne de la biomasse est plus pratique, avec la cytométrie de flux comme méthode préférée. À l'échelle de 1000L, l'optimisation du taux d'alimentation en méthanol améliore considérablement l'activité enzymatique, le rendement et la productivité, surpassant la fermentation en flacon.

Stratégie de co-alimentation

Le glycérol, en tant qu'inhibiteur du promoteur AOX1, doit être entièrement consommé avant l'induction au méthanol pour éviter de réprimer la production de protéines. Les co-sous-produits peuvent augmenter l'activité enzymatique, mais un excès de glycérol peut nuire à la croissance et à l'expression. Le sorbitol, l'acide ascorbique, le mannitol et d'autres peuvent remplacer le glycérol, réduisant la protéolyse et le temps de culture tout en améliorant l'expression des protéines.

La banque de souches nécessite l'adoption de méthodes de conservation appropriées et le placement dans un environnement adapté pour maintenir la stabilité des caractéristiques des souches. Yaohai Bio-Pharma peut répondre aux exigences de conservation au glycérol (via des congélateurs à ultra-basse température ou de l'azote liquide) et à la lyophilisation des levures et d'E. coli.

Stratégie induite par restriction

Dans Pichia pastoris, des conditions restrictives comme une faible teneur en DO, une concentration en méthanol et une limite en oxygène augmentent l'expression de protéines recombinantes. Les conditions limitées en oxygène activent le promoteur AOX1 via l'accumulation de méthanol, augmentant ainsi la production de protéines tout en réduisant la chaleur. L'induction à basse température améliore le rendement, l'activité, la stabilité et la viabilité cellulaire, mais entraîne des coûts supplémentaires de refroidissement. Le pH et la limitation en azote aident également à l'expression, nécessitant une prudence pour éviter les problèmes opérationnels. La limitation en azote augmente notablement la productivité spécifique des protéines.

Yaohai Bio-Pharma recherche également activement des partenaires institutionnels ou individuels à l'échelle mondiale et propose la rémunération la plus compétitive de l'industrie. Si vous avez des questions, n'hésitez pas à nous contacter : [email protected]