Exploiter la puissance de la stratégie de fermentation par lots

Pichia pastoris est largement utilisé dans la production de diverses protéines hétérologues. La technologie de fermentation à haute densité cellulaire (HCDF), mise en œuvre par alimentation Fed-Batch, a permis de produire à grande échelle des produits biopharmaceutiques et des enzymes industrielles. Dans des milieux contrôlés avec précision, l'utilisation de la technologie HCDF permet d'obtenir des protéines recombinantes à haut rendement, à haute activité et rentables.

Des recherches récentes indiquent que grâce aux stratégies HCDF, des efforts sont déployés pour augmenter la production et l'activité de protéines hétérologues dans Pichia pastoris. La technologie HCDF permet d'obtenir sans effort des groupes de cellules de haut niveau dans des milieux définis, permettant ainsi l'acquisition de protéines recombinantes abondantes avec une activité améliorée et des coûts réduits grâce au HCDF. Cependant, la sélection de la stratégie HCDF appropriée pour optimiser l'expression de haut niveau de protéines spécifiques dans Pichia pastoris reste un défi.

Fermentation à haute densité cellulaire (HCDF)

Pichia pastoris excelle dans la production de protéines hétérologues, privilégiée pour le HCDF dans les bioréacteurs automatisés. Le HCDF comporte 3 étapes : le lot de glycérol, l'alimentation et l'induction au méthanol. Yaohai Bio-Pharma possède plus d'une décennie d'expérience dans la fermentation microbienne et a participé à plus de 400 projets. L'entreprise possède une vaste expertise et une technologie bien développée, lui permettant d'utiliser diverses stratégies HCDF pour améliorer l'efficacité de la production de protéines.

Le méthanol sert à la fois d'inducteur d'AOX1 et de source de carbone, mais sa concentration doit être contrôlée pour éviter toute toxicité. L'évaluation de différentes stratégies d'alimentation au méthanol est essentielle pour optimiser la croissance de Pichia pastoris et l'expression des protéines

Stratégie d'induction du méthanol

Dans la stratégie d'induction de méthanol HCDF par lots alimentés, les stratégies d'induction basées sur l'état englobent un ensemble de méthodologies de contrôle qui régulent l'ajout supplémentaire de méthanol par le biais d'un contrôle en ligne/hors ligne ou avant/arrière. Parmi les stratégies d'induction statistique, les principales comprennent le μ-stat, le stat à l'oxygène dissous (DO), le stat au méthanol et le stat à la biomasse.

1.1 µ-stat

La stratégie μ-stat maintient la biomasse stable en contrôlant μ, en facilitant la reproductibilité et en étudiant l'effet de μ sur l'expression des protéines. Cependant, elle ne permet pas de contrôler directement le méthanol et l'OD, ce qui risque d'entraîner une accumulation et une génération de ROS.

1.2 DO-stat

La stratégie DO-stat régule indirectement l'alimentation en méthanol en contrôlant l'oxygène dissous pour maintenir l'oxygénation, mais elle ne fixe pas la concentration en méthanol et le taux de croissance, ce qui peut affecter l'étude de l'expression des protéines. L'oxygénation pose un défi dans la fermentation aérobie, et bien que la supplémentation en oxygène pur puisse être coûteuse et toxique, l'augmentation de la pression est une approche plus économique qui peut également améliorer l'activité des protéines.

1.3 Méthanol-stat

Le contrôle inadéquat de la concentration en méthanol limite les stratégies μ-stat et DO-stat. Les stratégies statistiques au méthanol, qui fonctionnent en mode marche/arrêt, sont sujettes à des fluctuations et manquent de précision. En revanche, les contrôleurs PID offrent une régulation plus précise de la concentration en méthanol, améliorant ainsi l'efficacité globale de la fermentation.

1.4 Biomasse-stat

La stratégie biomasse-stat définit la relation entre la biomasse et l'alimentation en méthanol, optimisant le taux d'alimentation en méthanol pour améliorer le rendement en protéines. La surveillance en ligne de la biomasse est plus pratique, la cytométrie en flux étant la méthode préférée. À une échelle de 1000 XNUMX L, l'optimisation du taux d'alimentation en méthanol améliore considérablement l'activité enzymatique, le rendement et la productivité, surpassant la fermentation en flacon.

Stratégie de co-alimentation

Le glycérol, en tant qu'inhibiteur du promoteur AOX1, doit être entièrement consommé avant l'induction au méthanol pour éviter de supprimer la production de protéines. Les co-substrats peuvent améliorer l'activité enzymatique, mais l'excès de glycérol peut nuire à la croissance et à l'expression. Le sorbitol, l'acide ascorbique, le mannitol et d'autres peuvent remplacer le glycérol, réduisant ainsi la protéolyse et le temps de culture, et améliorant l'expression des protéines.

La banque de souches nécessite l'adoption de méthodes de conservation appropriées et un placement dans un environnement approprié pour maintenir la stabilité des caractéristiques de la souche. Yaohai Bio-Pharma peut répondre aux exigences de conservation du stock de glycérol (via des congélateurs à très basse température ou de l'azote liquide) et de conservation par lyophilisation des levures et d'E. coli.

Stratégie induite par les restrictions

Chez Pichia pastoris, des conditions restrictives telles qu'une faible teneur en oxygène dissous, une concentration en méthanol et une limite en oxygène stimulent l'expression des protéines recombinantes. Les conditions limitées en oxygène activent le promoteur AOX1 via l'accumulation de méthanol, augmentant la production de protéines tout en réduisant la chaleur. L'induction à basse température améliore le rendement, l'activité, la stabilité et la viabilité cellulaire, mais ajoute des coûts de refroidissement. La limitation du pH et de l'azote favorise également l'expression, ce qui nécessite de la prudence pour éviter les problèmes opérationnels. La limitation en azote améliore considérablement la productivité protéique spécifique.

Yaohai Bio-Pharma recherche également activement des partenaires institutionnels ou individuels à l'échelle mondiale et propose la rémunération la plus compétitive du secteur. Si vous avez des questions, n'hésitez pas à nous contacter : [email protected]