Efficacité du plafonnement de l'ARNm

L'importance de l'analyse de l'efficacité du coiffage 5' de l'ARNm

La structure de la coiffe située à l'extrémité 5' de l'ARNm joue un rôle central dans la traduction, la stabilisation et le transport efficaces des ARNm au sein des eucaryotes. Dans le contexte de l'ARNm transcrit in vitro (IVT), la coiffe 5' est introduite via des processus de coiffage co-transcriptionnel ou de coiffage enzymatique. En tant que composant indispensable des ARN IVT, le capuchon 5' constitue un attribut de qualité critique (CQA) nécessitant une caractérisation complète tout au long du développement du processus et de la libération des lots.

Yaohai-Bio Pharma fournit des solutions complètes d'analyse de l'efficacité du coiffage 5', englobant la conception d'attelles oligonucléotidiques (sonde), le clivage de la RNase H, la chromatographie liquide haute performance en phase inversée IP-RP-Paire d'ions (IP-RP-HPLC)/chromatographie liquide. -spectrométrie de masse (LC-MS), analyse de données.

Exigences réglementaires pour l'intégrité de l'ARNm

Selon les considérations réglementaires de l’OMS, « l’intégrité de la structure de l’ARNm est considérée comme un attribut de qualité critique pour la libération de l’ARNm. Ainsi, un contrôle est nécessaire pour l’intégrité de l’ARNm, l’efficacité du coiffage 5’, la présence ou la longueur de la queue poly(A) 3’, etc.

Méthode analytique

Procédure

Étape 1. Conception d'attelles oligonucléotidiques (sonde)

La sonde de clivage, incorporant des 2'-O-méthylnucléotides et des tétradeoxyribonucléotides, sert à cliver un brin d'ARN complémentaire à des positions spécifiques lorsque la RNase H est présente. Cette méthode s’avère très utile pour la génération ciblée de fragments d’ARN plus gros.

Étape 2. Clivage de la RNase H

Une sonde biotinylée, stratégiquement conçue pour être complémentaire de l'extrémité 5' de l'ARNm, est appliquée conjointement avec la RNase H pour catalyser le clivage ciblé de l'oligonucléotide d'extrémité 5' possédant une structure de coiffe.

Étape 3. IP-RP-HPLC/LC-MS

Dans l’analyse LC-MS des oligonucléotides, le mode chromatographique préféré est la séparation en phase inversée par appariement d’ions (IP-RP) utilisant des additifs de phase mobile d’amine. Ceci est attribué à leur pouvoir de résolution supérieur et à leur compatibilité avec la spectrométrie de masse (MS).

Étape 4. L'analyse des données

Des masses distinctes observées dans les fragments de clivage comportant une coiffe m7GpppG, contrairement à ceux comportant une coiffe diphosphate, triphosphate ou G non méthylée (GpppG), facilitent leur identification et permettent d'estimer l'efficacité du coiffage.

Cas d’analyse d’efficacité de plafonnement avec LC – MS

Yaohai-Bio Pharma a développé des méthodes robustes pour l'analyse de l'efficacité du coiffage de l'ARNm, depuis la conception d'attelles oligonucléotidiques (sonde), le clivage de la RNase H, l'IP-RP-HPLC/LC-MS jusqu'à l'analyse des données.

Les chromatogrammes d'ions totaux (à gauche) et les spectres de masse par électropulvérisation (à droite) des fragments de clivage à l'extrémité 5'