Падрыхтоўка мРНК IVT

Транскрыпцыя in vitro (IVT) з'яўляецца пераважным метадам атрымання мРНК, здольным даць ад мікраграмаў да міліграмаў мРНК у лабараторным маштабе. Для даследчых мэт пастаўшчыкі рэагентаў распрацавалі ўніверсальныя рэакцыйныя сістэмы IVT, прыдатныя для мРНК сярэдняй даўжыні (1000-4000 нуклеатыдаў).

У гэтым артыкуле мы абагульнім транскрыпцыю in vitro (IVT) мРНК, уключаючы звычайную рэакцыйную сістэму IVT, якая выкарыстоўваецца ў лабараторным маштабе, і рэакцыйную сістэму IVT, прыдатную для звышдоўгіх мРНК (>9000 нуклеатыдаў).

Наборы дазваляюць капіраваць котранскрипцию з дапамогай CleanCap AG і зніжаюць імунагеннасць з дапамогай m1ψ. ДНКаза I выдаляе рэшткі ДНК. Нізкі выхад можа быць з-за дрэннага змешвання, акіслення рэагентаў або праблем з шаблонам ДНК, якія можна ліквідаваць цэнтрыфугаваннем, новымі рэагентамі, кантролем і рэгуляваннем колькасці шаблону/часу рэакцыі.

Yaohai Bio-Pharma пастаўляе розныя зборныя прадукты РНК IVT (вадкі/ліафілізаваны парашок) і гатовыя прадукты LNP, якія кадуюць вавёркі, такія як флуоресцентные вавёркі (eGFP, mCHERRY), люцыферазу, рэкамбіназу Cre і антыген OVA, для задавальнення розных эксперыментальных або праектных патрэбы.

Сістэма IVT для звышдоўгіх мРНК

Звычайная IVT можа не працаваць для занадта доўгай мРНК (>9000 нт). Неабходна глыбокае разуменне і рацыянальная налада кампанентаў IVT.

Шаблон ДНК: Лінеарызаваныя плазміды або прадукты ПЦР з адпаведнымі паслядоўнасцямі промоторов, раствораныя ў H2O без РНКаз. Для аптымальных умоў IVT рэкамендуецца канцэнтрацыя шаблону ДНК вышэй за 40 нМ.

DTT: Падтрымлівае актыўнасць фермента падчас транскрыпцыі. Свежы ДТТ трэба дадаць у рэакцыйны буфер для аптымальнай актыўнасці фермента.

Інгібітар РНКазы: Інгібіруе актыўнасць РНКазы і падтрымлівае стабільнасць мРНК.

Т7 РНК-палімераза: Каталізуе транскрыпцыю ДНК у РНК, адпаведную паслядоўнасці промотора. На актыўнасць РНК-полимеразы Т7 ўплываюць рн і іёны магнію.

Іёны магнію (Mg2+): Кафактар ​​для РНК-палімеразы. Занадта нізкія канцэнтрацыі зніжаюць эфектыўнасць транскрыпцыі, у той час як занадта высокія канцэнтрацыі прыводзяць да дэградацыі РНК. Свабодны [Mg2+] варта карэктаваць у залежнасці ад канцэнтрацыі нуклеатыдаў. Кожны нуклеатыд хелатирует адзін [Mg2+], таму канцэнтрацыя [Mg2+] павінна перавышаць агульную канцэнтрацыю нуклеатыдаў.

Нуклеазідтрыфасфаты (NTP): У якасці субстратаў NTP з'яўляюцца асноўнымі адзінкамі РНК. Канцэнтрацыі NTP вышэй за 7 мМ станоўча ўплываюць на выпрацоўку мРНК.

спермідын: Стабілізуе ДНК-ферментныя комплексы і стымулюе рэакцыі транскрыпцыі; аднак празмерныя канцэнтрацыі аказваюць інгібіруючы эфект. Рэкамендуемая канцэнтрацыя спермидина складае ад 1 да 3 мМ.

Неарганічная пірафасфатаза (PPase): Дадаецца ў рэакцыі IVT для прадухілення назапашвання неарганічных пірафасфат-іёнаў (PPi), пазбягаючы іх хелатирования з Mg2+ і забяспечваючы дастатковую колькасць вольнага Mg2+.

Выкарыстоўваючы наватарскую тэхналогію і вопыт мРНК IVT, Yaohai Bio-Pharma прадастаўляе ўсебаковую паслугу РНК IVT, якая ўключае распрацоўку паслядоўнасці, падрыхтоўку РНК IVT (з модамі m1ψ), цыклізацыю РНК, ачыстку, сублімацыйны сушку, інкапсуляцыю LNP і праверку якасці.

Мы таксама актыўна шукаем інстытуцыйных або індывідуальных глабальных партнёраў. Мы прапануем найбольш канкурэнтаздольную кампенсацыю ў галіны. Калі ў вас ёсць якія-небудзь пытанні, калі ласка, не саромейцеся звяртацца да нас: [email protected]