Падготовка IVT mRNA

Транскрыпцыя вітру (IVT) з'яўляецца найлепшым спосабам падгатовкі mRNA, якая здольная атрымаць мікраграмы да міліграмаў mRNA на лабараторным ўзроўні. Для навуковых цэлей постачальнікі рэагентаў развілі універсальныя сістэмы реакцый IVT, якія падходзяць для mRNA середняга дыяметру (1000-4000 нуклеатыдаў).

У гэтай артыкуле мы падзенемо транскрыпцыю in vitro (IVT) mRNA, уключыўшы традыцыйную сістэму реакцый IVT, выкарыстоўваную на лабараторным ўзроўні, і сістэму реакцый IVT, якая падходзіць для ультрадалгай mRNA (>9000 нуклеатыдаў).

Камплекты дазваляюць капіраваць карапусна з CleanCap AG і зменшваць імунагэннасць з m1ψ. DNase I адбярае залишковую DNA. Нізкі выход можа быць з-за поганага месціўвання, окysлення рэагентаў ці праблем з DNA-шаблонам, што можна перапанаваць чэрэз цэнтрывыду, свежыя рэагенты, кантролі і правядзенне змены колькасці шаблона/часу реакцыі.

Yaohai Bio-Pharma прынімае ўдзел у вырабе розных прадуктаў prefabrykavanykh IVT RNA (рыдкія/замарожаныя паўдэльцы) і LNP, якія кодуюць белкі, такія як флуорэсцэнтныя белкі (eGFP, mCHERRY), люцыфераза, рекамбіназа Cre і агент OVA, каб задавальняць розныя eksperymental'nyya цэлі.

Сістэма IVT для сверхдаўгіх mRNA

Звычайная IVT можа не дзейстаць для занадта даўгіх mRNA (>9000 нт). Патрэбна глыбокае разумеенне і рацыянальнае выраўноўванне кампанентаў IVT.

ДНК-шаблон: Лінейныя плазміды ці PCR-вынікі з адпаведнымі проматэрскімі паслядоўнасцямі, дыспонаванымі ў RNase-вільным H2O. Рэкамендуецца шаблон ДНК з канцэнтрацыяй больш за 40 нМ для оптымальных умоваў IVT.

DTT: Падтрzymлівае актыўнасць энзымоў падчас транскрыпцыі. Свежы DTT павінен быць дададзены ў буфер реакцыі для оптымальнай актыўнасці энзымоў.

Iнгібітар RNase: Iнгібіруе актыўнасць RNase і падтрzymлівае стаякасць mRNA.

Палімераза T7 RNA: Каталізуе транскрыпцыю ДНК у РНК, якая адпавадае прамутару. Актыўнасць палімеразы РНК T7 залежыць ад pH і агульнасці镁2+ іонаў.

Іоны magnesium (Mg2+): Кафактар для палімеразы РНК. Заніжаныя канцэнтрацыі рэдукуюць эфектыўнасць транскрыпцыі, дакліка зашкоджэння РНК. Свабодны [Mg2+] павінен быць ўсталяваны на аснове канцэнтрацыі нуклеатыдаў. Кожны нуклеатыд аб'ядноўвае адзін [Mg2+], таму [Mg2+] павінен перавышаць усягою суму нуклеатыдных канцэнтрацый.

Трыфосфат нуклеозідаў (NTP): Як субстраты, NTP з’яўляюцца базавымі едзініцамі РНК. Канцэнтрацыі NTP вышэй 7 мМ маюць пазітыўны ўплыв на вытворэнне мРНК.

Спермідын: Стабілізуе ДНК-энзымныя камплексы і стымулюе транскрыпцыйныя реакцыі; аднак занадта вялікія канцэнтрацыі маюць тормазны ўплыв. Рэкамендавана спермідынавая канцэнтрацыя паміж 1 і 3 мМ.

Пірафосфатаза (PPase): Дададзеныя ў адмоўныя адказы IVT, каб запасці накапліванне іянаў безмаштабнага піраффосфата (PPi), уяўляючы іх хэляцыю з Mg2+ і забяспечуя дастатчана свабоднага Mg2+.

Выкарыстоўваючы першапроходную тэхналогію і досвід IVT mRNA, Yaohai Bio-Pharma прынімае сістэмы паслуг аб IVT RNA, уключаючы дызайн секвенцыі, падготаванне IVT RNA (з мадыфікацыям m1ψ), цыклізацыю RNA, чысценьне, замарожанне, капсуляцыю LNP і тэсты якасці.

Мы таксама актыўна шукаем глобальныя партнёраў — інстытуцый ці індывідуальных. Мы прапановаем най konkurencyjaснейшую кампенсацыю ў промысле. Калі у вас ёсць якія-небудзь пытанні, калі ласка, не сціліцеся з нами звязацца: [email protected]