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mRNA의 3' 폴리(A) 꼬리(폴리아데노신)는 전사 후 조절에 필수적이며 mRNA 수출, 안정성 및 번역에 영향을 미칩니다. 시험관 내 전사(IVT) mRNA의 경우, 폴리(A) 꼬리는 주형 방식으로 공동 전사 중에 도입되거나 비주형 방식으로 효소 꼬리화 과정을 통해 도입됩니다. 이 3' 폴리(A)는 IVT RNA에 대한 중요한 품질 속성(CQA) 역할을 하며 공정 개발 및 배치 출시 동안 철저한 특성화가 필요합니다.
Yaohai Bio-Pharma는 리보뉴클레아제 T3(RNase T1) 절단, 이온쌍 역상 고성능 액체 크로마토그래피(IP-RP-HPLC)/액체 크로마토그래피-질량 분석법과 같은 기술을 사용하여 전문적인 1' 폴리(A) 특성 분석 서비스를 제공합니다. (LC-MS) 및 포괄적인 데이터 분석.
WHO 규제 고려사항에 따르면, “mRNA 구조의 완전성은 mRNA 방출에 있어 중요한 품질 특성으로 간주됩니다. 따라서 mRNA 무결성, 5' 캡핑 효율성, 3' 폴리(A) 꼬리 존재 또는 길이 등에 대한 제어가 필요합니다."
분석 | 행동 양식 |
mRNA 3' 폴리(A) 특성화 | L소화 후 C-MS |
LC-MS를 통한 전체 길이의 손상되지 않은 mRNA를 직접 분석하는 것은 크기와 이질성으로 인해 실용적이지 않습니다. 폴리(A) 꼬리를 검사하려면 전체 길이의 mRNA에서 절단되어야 합니다. 널리 사용되는 방법은 RNase T1을 이용한 효소 분해로, 폴리(A) 서열을 보존하면서 rG의 3' 말단을 선택적으로 절단하는 것입니다. mRNA 샘플은 RNase T1으로 소화되고, 폴리(A) 스트레치를 포함하는 절단 조각은 올리고 dT 코팅 자기 비드를 사용하여 분리됩니다.
추출된 꼬리는 LC-MS를 사용하여 분석되었으며 단일 뉴클레오티드 분해능에서 정확한 꼬리 길이 정보를 제공했습니다. 올리고뉴클레오티드 LC-MS 분석에서 아민 이동상 첨가제를 사용한 이온쌍 역상(IP-RP) 분리는 강력한 분해능과 질량분석법(MS)과의 호환성으로 인해 선호되는 크로마토그래피 모드입니다.
폴리(A) 꼬리 길이와 그 상대적 풍부함은 피크의 수와 강도를 아데노신의 질량으로 나눈 값에 따라 달라집니다. 질량 스펙트럼을 처리하거나 디콘볼루션하면 100량체 폴리(A) 꼬리(상자 내 33,163Da)의 예상 질량이 식별되며, 아데노신(A)의 질량에 해당하는 329amu 간격의 일련의 질량이 함께 표시됩니다. .
Yaohai-BioPharma는 RNase T3 절단 및 IP-RP-HPLC/LC-MS를 포함하여 mRNA 1' 폴리(A) 특성 분석을 위한 강력한 방법을 개발했습니다.
Yaohai-BioPharma는 RNase T3 절단 및 IP-RP-HPLC/LC-MS를 포함하여 mRNA 1' 폴리(A) 특성 분석을 위한 강력한 방법을 개발했습니다.
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