高品質プラスミド抽出の秘密を解明

プラスミド抽出は研究者にとって重要です。遺伝子ベクターとしてのプラスミドは、品質が重要となるワクチン研究や遺伝子治療において不可欠です。重要な品質要因には、スーパーコイルの割合とエンドトキシン含有量が含まれます。規制はさまざまです。FDA ≥80%、SMPA ≥85%、NMPA ≥90%、直鎖/開環状 DNA は 5% 未満です。クライアントは多くの場合、≥95% のスーパーコイルを好みます。エンドトキシン レベルは、研究 (>50 EU/µg)、トランスフェクション (<50 EU/µg)、エンドトキシン フリー (<0.1 EU/µg) です。

スーパーコイルプラスミドDNA

大腸菌由来のプラスミドには、スーパーコイル (SC)、開環 (OC)、および直鎖 (L) DNA が含まれます。SC の割合が高いと、トランスフェクションの効率と発現が向上します。たとえば、85.45% SC プラスミドのトランスフェクションは 2.5 倍高く、93.28% SC プラスミドの HGF 発現は 1.8 倍高く、SC DNA の優位性が実証されています。

開環状 DNA: 二本鎖 DNA の 1 つの鎖が切断されると、超らせん構造が緩み、より大きな体積を持つ開環状プラスミドが形成されます。このプラスミドは電気泳動中に最も遅く移動し、上部に位置します。

線状 DNA: プラスミド DNA の両方の鎖が切断されると、線状構造が形成されます。線状構造は比較的小さな体積を持ち、開環状 DNA よりも速く移動しますが、2 番目に位置するスーパーコイル DNA よりも遅く移動します。

超らせん DNA: 2 つのらせんが絡み合って、DNA のらせんに基づいて超らせん構造を形成します。体積が最も小さく、電気泳動中に最も速く移動し、下部に位置します。

超らせん構造の割合の定量分析

研究室では、アガロースゲル電気泳動 (AGE) と Gel-Pro Analyzer を使用して、電気泳動画像からスーパーコイルの割合を判断します。97.539 つの画像では 63.833% の SC DNA が示され、もう 36.167 つの画像では XNUMX% の SC DNA と XNUMX% の OC DNA (線状 DNA は見えません) が示されています。

プラスミドのエンドトキシンの秘密

エンドトキシンはグラム陰性細菌の細胞壁の外層の成分で、細菌の死後または溶解後に放出され、毒性のあるリポ多糖 A を含んでいます。プラスミド抽出中に、エンドトキシンが溶解溶液に入り込み、トランスフェクション効率に影響を与え、非特異的免疫反応を引き起こし、実験で偽陽性を引き起こします。

エンドトキシンの定量・定性分析

Limulus Amebocyte Lysate (LAL) テストは、リポ多糖類 (LPS) 内の 2-ケト-3-デオキシオクトン酸 (KDO) との凝集を介してエンドトキシンを検出します。定性的および半定量的であり、サンプルと混合すると凝固または色の変化によってエンドトキシンの存在を示します。

Yaohai Bio-Pharma は、エンドトキシンフリーのスーパーコイルプラスミドを提供しています。Yaohai にアウトソーシングすることで、トランスフェクションと発現の効率が向上します。納品されるプラスミドは、SC 比率が 95% 以上 (平均 85%±10%)、エンドトキシン レベルが ≤0.1、≤0.01、または ≤0.005 EU/μg です。

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