大規模遺伝子合成のための革新的な組み立て技術 日本

大きな DNA 断片をゼロから合成するアセンブリ技術は、遺伝子合成の基礎であり、BioBrick™、TAR、BglBrick、Golden Gate、ギブソンアセンブリ、CPEC、オーバーラップ PCR などの方法が含まれます。現在の技術では、遺伝子の長さの DNA を 1 ステップで正確に合成することが難しいため、セグメントで合成されたオリゴヌクレオチド断片を長い DNA 断片に組み立てるには、in vitro と in vivo のアセンブリ技術を組み合わせる必要があります。

インビトロアセンブリ技術

これらは、断片のサイズと配列特性に基づいてさまざまな方法に分類されますが、ツール酵素を使用するという共通要件があります。DNAポリメラーゼ法に基づくオーバーラップPCRは、操作が簡単で迅速です。アイソシゾマーに依存するBioBrick法とBglBrick法は、標準化されたアセンブリを可能にしますが、BioBrick法は融合タンパク質には適していません。タイプIIS制限酵素に基づくゴールデンゲートクローニング法は、複数の断片を効率的にシームレスにライゲーションできます。複数のツール酵素の組み合わせを使用するギブソンアセンブリ法は、数百kbに達する断片サイズのシームレスライゲーションを可能にします。DNAコンポーネントの標準化された設計は、既存の断片の利用率を高めます。

生体内アセンブリ技術

しかし ビトロ 組み立てられた断片は数百kbの大きさに達することがあるが、収量は不十分なことが多く、次のような生物を用いた増幅が必要となる。 Escherichiacoli。 20 kb を超える断片を組み立てるには、枯草菌、酵母、遺伝子組み換え細菌などの生物内での組み換えシステムがよく使用されます。一般的に使用される宿主である酵母は、長年にわたって効率的な相同組み換え能力が認められてきました。酵母は、最大数メガベース (Mb) の長さの人工染色体を組み立てるために使用できます。さらに、サッカロミセス セレビシエは染色体の長さに対して並外れた耐性を示し、酵母を利用して高等生物で超長染色体を構築するための理論的根拠を提供します。

アプリケーション

Yaohai Bio-Pharma は、遺伝子合成に主にリガーゼアセンブリと DNA ポリメラーゼアセンブリという 5 つのアセンブリ方法を採用しています。リガーゼアセンブリ方法では、DNA リガーゼを使用して、重複してハイブリダイズした XNUMX' リン酸化オリゴヌクレオチド断片を二本鎖 DNA に結合します。ポリメラーゼアセンブリ方法では、DNA ポリメラーゼを使用して、重複したオリゴヌクレオチド断片をハイブリダイゼーションによって延長し、異なる長さの混合物を取得し、最後にプライマーを使用して正常にアセンブリされた全長断片を増幅します。Yaohai は、クライアントが遺伝子合成の特定の要件を満たすのを支援できます。

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