Metodi per migliorare il rendimento del pDNA

La produzione di DNA plasmidico (pDNA) si basa sulla ricombinazione genetica, che prevede la connessione del gene target e altri elementi per formare una struttura circolare chiusa covalentemente. La fermentazione ad alta densità cellulare Escherichia Coli e purificazione sono i principali metodi per produrre pDNA.

Lo sviluppo della terapia cellulare e genica (CGT) e dell'mRNA ha aperto nuove possibilità per prevenire malattie epidemiche e trattare malattie rare. La produzione industriale di CGT e mRNA richiede pDNA di alta qualità . Pertanto, fermentazione ottimizzata di E. coli e alto rendimento di pDNA sono fondamentali per l'efficienza economica dei vaccini/farmaci CGT e mRNA.

1. Aumento della richiesta di pDNA

Secondo il Rapporto sul Mercato di Produzione di DNA Plasmidico negli Stati Uniti, il mercato CGT è previsto che cresca da 7,2 miliardi di dollari USA nel 2023 a 23,3 miliardi di dollari USA nel 2028. Inoltre, la terapia genica diventerà la direzione dominante del CGT. Un numero crescente di terapie CGT vengono approvate per il lancio sul mercato e più pipeline stanno entrando nella fase clinica. Di conseguenza, la domanda di pDNA sta aumentando rapidamente.

Oltre alle terapie CGT, il pDNA è un materiale grezzo essenziale per la produzione di vaccini mRNA. Con l'innovazione continua della tecnologia mRNA nei campi dei vaccini contro le malattie infettive, dei vaccini contro il cancro e delle terapie per le malattie rare, la domanda di pDNA crescerà rapidamente.

2. Metodi per migliorare il rendimento del pDNA

Con l'aumento della richiesta di DNA plasmidico, l'attuale focus dello sviluppo tecnologico è sulla ottimizzazione delle strategie di fermentazione per migliorare il rendimento di pDNA. Le condizioni chiave per lo sviluppo del processo upstream includono componenti del mezzo di coltura, temperatura, pH, ossigeno dissolto (DO), tasso di produzione specifico e strategie fed-batch.

Mezzo di coltura: Il mezzo di coltura per la fermentazione di E. coli usato nella produzione di plasmidi è tipicamente un mezzo semi-sintetico. È composto da sorgenti di carbonio, sorgenti di azoto, sali inorganici ed elementi traccia. Tra questi, i tipi di sorgenti di carbonio e azoto sono fondamentali per la crescita di E. coli e l'accumulo dei prodotti. Le sorgenti di carbonio comunemente utilizzate sono glucosio e glicerolo, mentre le sorgenti di azoto includono azoto organico e inorganico. Inoltre, un rapporto eccessivamente alto tra carbonio e azoto (C/N) può rallentare la crescita della ceppa batterica, mentre un rapporto C/N eccessivamente basso può promuovere una crescita rapida ma limitare l'accumulo del prodotto.

Temperatura : La temperatura ottimale per la crescita di E. coli è 37°C. Tuttavia, temperature più basse (30-37°C) possono essere utilizzate nella fermentazione a batch per ridurre il tasso specifico di produzione massimo, aumentando così la replicazione del plasmide. Per plasmidi sensibili al calore, aumentare la temperatura a 42°C può indurre un raddoppio del numero di copie del plasmide.

pH : Il pH ottimale per la crescita di E. coli è 7±0,2. Il pH del brodo di fermentazione viene solitamente mantenuto attraverso pompe acido-base.

DO : L'intervallo critico di concentrazione di ossigeno disciolto per E. coli è tra il 20% e il 30%. Un'ossigenazione insufficiente può portare a una produzione eccessiva di acido acetico, influenzando la crescita batterica e causando persino l'autolisi batterica. Un'eccessiva ossigenazione può causare avvelenamento da ossigeno. I fattori che influiscono sull'ossigeno disciolto includono la velocità di agitazione, il tasso di aerazione, ecc.

Strategia a batch alimentato : La fermentazione a batch alimentato viene spesso scelta per la produzione di plasmidi. Innanzitutto, è favorevole per raggiungere una fermentazione ad alta densità cellulare di E. coli, il che porta a un maggior biomassa, che costituisce la base per un alto rendimento. In secondo luogo, la crescita eccessivamente rapida di Escherichia coli influisce sulla stabilità del plasmide. L'aggiunta di nutrienti restrittivi utilizzando il metodo fed-batch può controllare razionalmente il tasso di crescita di E. coli , migliorando così il rendimento del plasmide. La strategia di controllo DO-stat è comunemente utilizzata per regolare il processo fed-batch durante la fermentazione del plasmide. Esistono anche ricerche che indicano la fattibilità della strategia pH-stat.

3. Servizi forniti da Yaohai Bio-Pharma

Yaohai Bio-Pharma ha sviluppato una piattaforma matura per la produzione di plasmidi. Inoltre, Yaohai Bio-Pharma ha ottimizzato il mezzo di coltura di base, il mezzo di alimentazione e la strategia di controllo della fermentazione. All'interno di un ciclo di coltivazione di 30 ore, il rendimento del plasmide supera i 1g/L.

Inoltre, Yaohai Bio-Pharma è in grado di fornire soluzioni di ottimizzazione del processo basate su metodi a singolo fattore o Design of Experiments (DoE) per diversi plasmidi e batteri ospiti. Yaohai Bio-Pharma si impegna a soddisfare i requisiti dei clienti in termini di alto rendimento e qualità dei plasmidi.

Yaohai Bio-Pharma sta inoltre attivamente cercando partner istituzionali o individuali a livello globale e offre le compensazioni più competitive dell'industria. Se hai domande, non esitare a contattarci: [email protected]