Processo di produzione dell'mRNA eGFP

La produzione di mRNA di eGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein) comporta una serie di tecniche di biologia molecolare per generare una molecola di RNA funzionale che codifica per l'espressione di eGFP. Nell'area di mRNA di eGFP, Yaohai Bio-Pharma ha accumulato una vasta esperienza nel soddisfare le esigenze specifiche dei clienti. Sfruttando la nostra esperienza, abbiamo sintetizzato il flusso di processo per la produzione di mRNA di EGFP.

1. Clonazione del gene eGFP: Per ottenere la sequenza genica che codifica per eGFP. Questo gene è solitamente clonato da un vettore plasmidico preesistente o sintetizzato artificialmente in base alla sequenza nucleotidica nota. Il gene clonato viene quindi verificato tramite sequenziamento per garantirne l'accuratezza.
2. Ottimizzazione genica per l'espressione: Per un'espressione ottimale nel sistema target (ad esempio, cellule di mammiferi, batteri o sistemi di trascrizione in vitro), il gene eGFP può essere sottoposto a ottimizzazione dei codoni. Ciò comporta la sostituzione di codoni rari nella sequenza originale con quelli più frequentemente utilizzati nell'organismo ospite, aumentando le possibilità di una traduzione efficiente.
3. In vitro Preparazione del modello di trascrizione: Una volta che il gene ottimizzato è pronto, viene incorporato in un vettore adatto, spesso un plasmide, che contiene elementi regolatori necessari per la trascrizione (ad esempio, una sequenza promotore). Questo plasmide funge da modello per la trascrizione in vitro.
4. In vitro Trascrizione: Utilizzando il modello plasmidico preparato, viene eseguita la trascrizione in vitro per sintetizzare l'mRNA eGFP. Questo processo prevede l'uso di enzimi RNA polimerasi, che riconoscono la sequenza del promotore e avviano la trascrizione, producendo un filamento di RNA complementare al modello di DNA. A seconda dell'applicazione desiderata, l'mRNA può essere tappato, poliadenilato e/o modificato per migliorare la stabilità e l'efficienza della traduzione.
5. Purificazione e controllo qualità: L'mRNA eGFP sintetizzato viene quindi purificato per rimuovere eventuali contaminanti, tra cui DNA, proteine ​​e nucleotidi liberi. I metodi di purificazione possono includere elettroforesi su gel, cromatografia su colonna o separazione basata su microsfere. Dopo la purificazione, l'mRNA viene analizzato per qualità, tra cui concentrazione, purezza e integrità, utilizzando tecniche come spettrofotometria UV-Vis ed elettroforesi su gel.
6. Conservazione e consegna: L'mRNA eGFP purificato viene solitamente conservato a basse temperature per mantenerne la stabilità. Per uso sperimentale, l'mRNA può essere somministrato alle cellule utilizzando vari metodi, tra cui elettroporazione, lipofezione o vettori virali, a seconda dell'applicazione specifica e del tipo di cellula bersaglio.
7. Espressione e verifica: Una volta all'interno della cellula, l'mRNA eGFP viene tradotto nella proteina fluorescente verde potenziata, che può essere visualizzata tramite microscopia a fluorescenza. Ciò consente la verifica della produzione, della somministrazione e dell'espressione di mRNA di successo.

In sintesi, la produzione di mRNA eGFP comporta la clonazione del gene, la sua ottimizzazione per l'espressione, la preparazione di un modello di trascrizione in vitro, l'esecuzione della reazione di trascrizione, la purificazione dell'mRNA risultante e, infine, la sua somministrazione alle cellule per l'espressione e la verifica.

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