Tecniche di assemblaggio innovative per la sintesi genica su larga scala

La tecnologia di assemblaggio per la sintesi di grandi frammenti di DNA da zero è la pietra angolare della sintesi genica, che comprende metodi quali BioBrick™, TAR, BglBrick, Golden Gate, Gibson assembly, CPEC e Overlap PCR. A causa delle limitazioni della tecnologia attuale nella sintesi accurata di DNA di lunghezza genica in un unico passaggio, è necessario combinare tecniche di assemblaggio in vitro e in vivo per assemblare frammenti di oligonucleotidi sintetizzati in segmenti in lunghi frammenti di DNA.

Tecniche di assemblaggio in vitro

Sono classificati in vari metodi in base alle dimensioni del frammento e alle caratteristiche della sequenza, con un requisito comune per l'utilizzo di enzimi di strumento. La PCR sovrapposta, basata sul metodo della DNA polimerasi, è semplice e rapida da usare. I metodi BioBrick e BglBrick, che si basano sugli isoschizomeri, consentono un assemblaggio standardizzato, sebbene il metodo BioBrick non sia adatto per le proteine ​​di fusione. Il metodo di clonazione Golden Gate, basato sugli enzimi di restrizione di tipo IIS, consente un'efficiente legatura senza soluzione di continuità di più frammenti. Il metodo di assemblaggio Gibson, che utilizza una combinazione di più enzimi di strumento, consente una legatura senza soluzione di continuità con dimensioni dei frammenti che raggiungono diverse centinaia di kb. La progettazione standardizzata dei componenti del DNA migliora il tasso di utilizzo dei frammenti esistenti.

Tecniche di assemblaggio in vivo

Sebbene il in vitro i frammenti assemblati possono raggiungere dimensioni di diverse centinaia di kb, la resa è spesso insufficiente, rendendo necessaria l'amplificazione utilizzando organismi come Escherichia coli. Nell'assemblaggio di frammenti superiori a 20 kb, vengono spesso impiegati sistemi ricombinanti all'interno degli organismi, tra cui Bacillus subtilis, lievito e batteri ingegnerizzati. Il lievito, come ospite comunemente utilizzato, è stato riconosciuto per la sua efficiente capacità di ricombinazione omologa per molti anni. Può essere utilizzato per assemblare cromosomi artificiali lunghi fino a diverse megabasi (Mb). Inoltre, Saccharomyces cerevisiae mostra una straordinaria tolleranza per la lunghezza dei cromosomi, fornendo una base teorica per l'utilizzo del lievito per costruire cromosomi ultra-lunghi in organismi superiori.

Applicazioni

Yaohai Bio-Pharma impiega principalmente due metodi di assemblaggio per la sintesi genica: assemblaggio ligasi e assemblaggio DNA polimerasi. Il metodo di assemblaggio ligasi collega frammenti di oligonucleotidi 5'-fosforilati sovrapposti e ibridati in DNA a doppio filamento utilizzando DNA ligasi. Il metodo di assemblaggio polimerasi utilizza DNA polimerasi per estendere i frammenti di oligonucleotidi sovrapposti tramite ibridazione, ottenendo una miscela di diverse lunghezze e infine amplificando i frammenti a lunghezza intera assemblati con successo utilizzando primer. Yaohai può aiutare i clienti a soddisfare requisiti specifici nella sintesi genica.

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