Tecniche di Assemblaggio Innovative per la Sintesi Genica su Large-Scale

La tecnologia di assemblaggio per sintetizzare frammenti di DNA grandi a partire da zero è la pietra angolare della sintesi genica, comprendendo metodi come BioBrick™, TAR, BglBrick, Golden Gate, Gibson assembly, CPEC e Overlap PCR. A causa delle limitazioni della tecnologia attuale nella sintesi precisa di DNA della lunghezza di un gene in un unico passaggio, è necessario combinare tecniche di assemblaggio in vitro e in vivo per assemblare frammenti di oligonucleotidi sintetizzati in segmenti in frammenti di DNA lunghi.

Tecniche di assemblaggio in vitro

Vengono classificati in vari metodi in base alla dimensione del frammento e alle caratteristiche della sequenza, con un requisito comune per l'uso di enzimi strumentali. L'overlap PCR, basato sul metodo di DNA polimerasi, è semplice e rapido da eseguire. I metodi BioBrick e BglBrick, che si basano su isoschizomeri, consentono un assemblaggio standardizzato, sebbene il metodo BioBrick non sia adatto per proteine di fusione. Il metodo di clonazione Golden Gate, basato sugli enzimi di restrizione tipo IIS, consente una ligatura efficiente senza soluzione di continuità di più frammenti. Il metodo di assemblaggio Gibson, che utilizza una combinazione di più enzimi strumentali, consente una ligatura senza soluzione di continuità con dimensioni di frammento che possono raggiungere diverse centinaia di kb. La progettazione standardizzata dei componenti DNA aumenta il tasso di utilizzo dei frammenti esistenti.

Tecniche di assemblaggio in vivo

Anche se in vitro i frammenti assemblati possono raggiungere dimensioni di diverse centinaia di kb, ma il rendimento è spesso insufficiente, necessitando di amplificazione tramite organismi come Escherichia coli. Nell'assemblaggio di frammenti superiori a 20 kb, vengono spesso utilizzati sistemi ricombinanti all'interno degli organismi, inclusi Bacillus subtilis, lieviti e batteri ingegnerizzati. I lieviti, come ospite comune, sono stati riconosciuti per la loro capacità di ricombinazione omologa efficiente per molti anni. Possono essere usati per assemblare cromosomi artificiali fino a diverse megabasi (Mb) di lunghezza. Inoltre, Saccharomyces cerevisiae mostra una straordinaria tolleranza per la lunghezza del cromosoma, fornendo una base teorica per l'utilizzo dei lieviti nella costruzione di cromosomi ultra-lunghi negli organismi superiori.

Applicazioni

Yaohai Bio-Pharma utilizza principalmente due metodi di assemblaggio per la sintesi di geni: assemblaggio con ligasi e assemblaggio con DNA polimerasi. Il metodo di assemblaggio con ligasi connette frammenti oligonucleotidici 5'-fosforilati sovrapposti e ibridizzati in DNA a doppia elica utilizzando la DNA ligasi. Il metodo di assemblaggio con polimerasi utilizza la DNA polimerasi per estendere i frammenti oligonucleotidici sovrapposti attraverso l'ibridazione, ottenendo una miscela di diverse lunghezze, e infine amplificando i frammenti full-length assemblati con successo utilizzando dei primer. Yaohai può aiutare i clienti a soddisfare requisiti specifici nella sintesi di geni.

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