Descubriendo los Secretos de la Extracción de Plásmidos de Alta Calidad

La extracción de plásmidos es crucial para los investigadores. Como vectores genéticos, los plásmidos son vitales en la investigación de vacunas y terapia génica, donde la calidad importa. Factores clave de calidad incluyen la proporción superenrollada y el contenido de endotoxinas. Las regulaciones varían: FDA ≥80%, SMPA ≥85%, NMPA ≥90%, con <5% de ADN lineal/circular abierto. Los clientes a menudo prefieren ≥95% superenrollado. Los niveles de endotoxinas son: investigación (>50 EU/µg), transfección (<50 EU/µg) y libre de endotoxinas (<0.1 EU/µg).

ADN de plásmido superenrollado

Los plásmidos de Escherichia coli incluyen ADN superenrollado (SC), circular abierto (OC) y lineal (L). Una alta proporción de SC mejora la eficiencia de transfección y la expresión. Por ejemplo, una transfección de un plásmido SC del 85.45% es 2.5 veces mayor, y la expresión de HGF de un plásmido SC del 93.28% es 1.8 veces mayor, confirmando la superioridad del ADN SC.

ADN circular abierto: Cuando una de las hebras del ADN de doble cadena se rompe, la estructura superenrollada se afloja, formando un plásmido circular abierto con un volumen mayor que migra más lentamente durante la electroforesis y se encuentra en la parte superior.

ADN lineal: Cuando ambas hebras del ADN plasmídico se rompen, se forma una estructura lineal, con un volumen relativamente menor que migra más rápido que el ADN circular abierto pero más lento que el ADN superenrollado, posicionándose en segundo lugar.

ADN superenrollado: Las dos hélices se entrelazan, torciéndose en una estructura superenrollada basada en la hélice de ADN. Tiene el volumen más pequeño y migra más rápido durante la electroforesis, posicionándose en la parte inferior.

Análisis Cuantitativo de la Proporción Superenrollada

Los laboratorios utilizan la electroforesis en gel de agarosa (AGE) y Gel-Pro Analyzer para juzgar la proporción superenrollada a través de imágenes de electroforesis. Una imagen muestra un 97,539% de ADN SC, mientras que otra muestra un 63,833% de ADN SC y un 36,167% de ADN OC (el ADN lineal no es visible).

El Secreto de los Endotoxinas en los Plásmidos

El endotoxina es un componente de la capa externa de la pared celular de las bacterias Gram-negativas, liberado después de la muerte o lisado bacteriano, que contiene lipopolisacárido tóxico A. Durante la extracción de plásmidos, el endotoxina entra en la solución de lisis, afectando la eficiencia de la transfección y desencadenando respuestas inmunes no específicas, lo que puede llevar a falsos positivos en los experimentos.

Análisis Cuantitativo y Cualitativo del Endotoxina

La prueba de lisado de amebocitos de Limulus (LAL) detecta el endotoxina mediante la aglutinación con ácido 2-ceto-3-desoxioctónico (KDO) en el lipopolisacárido (LPS). Es cualitativa y semi-cuantitativa, indicando la presencia de endotoxina a través de coagulación o cambio de color al mezclarse con muestras.

Yaohai Bio-Pharma ofrece plásmidos superenrollados libres de endotoxinas. Subcontratar a Yaohai mejora la eficiencia de transfección y expresión. Los plásmidos entregados tienen una proporción ≥95% SC (promedio 85%±10%) y niveles de endotoxina ≤0.1, ≤0.01 o ≤0.005 EU/μg.

También estamos buscando activamente socios globales institucionales o individuales. Ofrecemos la compensación más competitiva de la industria. Si tiene alguna pregunta, no dude en contactarnos: [email protected]