Descubriendo los secretos de la extracción de plásmidos de alta calidad

La extracción de plásmidos es crucial para los investigadores. Como vectores genéticos, los plásmidos son vitales en la investigación de vacunas y la terapia génica, donde la calidad es importante. Los factores clave de calidad incluyen la proporción de superenrollamiento y el contenido de endotoxinas. Las regulaciones varían: FDA ≥80%, SMPA ≥85%, NMPA ≥90%, con <5% de ADN lineal/circular abierto. Los clientes a menudo prefieren ≥95% de superenrollamiento. Los niveles de endotoxinas son: investigación (>50 EU/µg), transfección (<50 EU/µg) y libre de endotoxinas (<0.1 EU/µg).

ADN plasmídico superenrollado

Los plásmidos de Escherichia coli incluyen ADN superenrollado (SC), circular abierto (OC) y lineal (L). Una alta proporción de SC aumenta la eficiencia y la expresión de la transfección. Por ejemplo, la transfección de un plásmido con un 85.45 % de SC es 2.5 veces mayor, y la expresión de HGF de un plásmido con un 93.28 % de SC es 1.8 veces mayor, lo que confirma la superioridad del ADN de SC.

ADN circular abierto: cuando una hebra de ADN bicatenario se rompe, la estructura superenrollada se afloja y forma un plásmido circular abierto con un volumen mayor que migra más lentamente durante la electroforesis y se posiciona en la parte superior.

ADN lineal: Cuando ambas cadenas de ADN plasmídico se rompen, se forma una estructura lineal, con un volumen relativamente menor que migra más rápido que el ADN circular abierto pero más lento que el ADN superenrollado, posicionada en segundo lugar.

ADN superenrollado: dos hélices se entrelazan y forman una estructura superenrollada basada en la hélice del ADN. Tiene el menor volumen y migra más rápido durante la electroforesis, y se ubica en la parte inferior.

Análisis cuantitativo de la proporción superenrollada

Los laboratorios utilizan la electroforesis en gel de agarosa (AGE) y el analizador Gel-Pro para evaluar la proporción de superenrollamiento a través de imágenes de electroforesis. Una imagen muestra un 97.539 % de ADN de células madre, mientras que otra muestra un 63.833 % de ADN de células madre y un 36.167 % de ADN de células madre (ADN lineal no visible).

El secreto de las endotoxinas en los plásmidos

La endotoxina es un componente de la capa externa de la pared celular de las bacterias gramnegativas, que se libera después de la muerte o lisis bacteriana y que contiene lipopolisacárido A tóxico. Durante la extracción del plásmido, la endotoxina ingresa a la solución de lisis, lo que afecta la eficiencia de la transfección y desencadena respuestas inmunes no específicas, lo que lleva a falsos positivos en los experimentos.

Análisis cuantitativo y cualitativo de endotoxinas

La prueba del lisado de amebocitos de Limulus (LAL) detecta la endotoxina mediante aglutinación con ácido 2-ceto-3-desoxioctónico (KDO) en el lipopolisacárido (LPS). Es cualitativa y semicuantitativa, e indica la presencia de endotoxina mediante coagulación o cambio de color cuando se mezcla con muestras.

Yaohai Bio-Pharma ofrece plásmidos superenrollados sin endotoxinas. La subcontratación a Yaohai aumenta la eficiencia de la transfección y la expresión. Los plásmidos entregados tienen una proporción de SC ≥95 % (promedio 85 % ± 10 %) y niveles de endotoxinas ≤ 0.1, ≤ 0.01 o ≤ 0.005 EU/μg.

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