Aprovechando el Poder de la Estrategia de Fermentación Fed-batch

Pichia pastoris se utiliza ampliamente en la producción de varios proteínas heterólogas. La tecnología de Fermentación de Alta Densidad Celular (HCDF), implementada a través del alimentación Fed-Batch, ha logrado con éxito la producción a gran escala de biofármacos y enzimas industriales. En medios de cultivo controlados con precisión, el uso de la tecnología HCDF puede obtener proteínas recombinantes de alta producción, alta actividad y costo-efectivas.

Investigaciones recientes indican que mediante estrategias HCDF se están realizando esfuerzos para aumentar la producción y actividad de proteínas heterólogas en Pichia pastoris. La tecnología HCDF permite alcanzar fácilmente conglomerados celulares de alto nivel en medios definidos, lo que facilita la obtención de abundantes proteínas recombinantes con mayor actividad y costos reducidos a través de HCDF. Sin embargo, seleccionar la estrategia HCDF adecuada para optimizar la expresión de alto nivel de proteínas específicas en Pichia pastoris sigue siendo un desafío.

Fermentación de Alta Densidad Celular (HCDF)

Pichia pastoris destaca en la producción de proteínas heterólogas, siendo favorecida para el HCDF en biorreactores automatizados. El HCDF tiene 3 etapas: lote de glicerol, alimentación y inducción con metanol. Yaohai Bio-Pharma cuenta con más de una década de experiencia en fermentación microbiana y ha atendido más de 400 proyectos. La empresa posee una amplia experiencia y tecnología bien desarrollada, lo que le permite utilizar diversas estrategias de HCDF para mejorar la eficiencia en la producción de proteínas.

El metanol sirve tanto como un inductor de AOX1 como fuente de carbono, pero su concentración debe controlarse para evitar toxicidad. Evaluar diferentes estrategias de suministro de metanol es crucial para optimizar el crecimiento de Pichia pastoris y la expresión de proteínas.

Estrategia de inducción con metanol

En la estrategia de inducción con metanol en el proceso HCDF por lotes alimentados, las estrategias de inducción basadas en el estado abarcan un conjunto de metodologías de control que regulan la adición suplementaria de metanol a través del control en línea/offline o hacia adelante/hacia atrás. Entre las estrategias estadísticas de inducción, las principales incluyen μ-stat, Dissolved Oxygen (DO)-stat, methanol-stat y biomass-stat.

1.1 μ-stat

la estrategia μ-stat mantiene el biomasa constante controlando μ, lo que ayuda a la reproducibilidad y al estudio del efecto de μ en la expresión de proteínas. Sin embargo, carece de un control directo de metanol y DO, corriendo el riesgo de acumulación y generación de ROS.

1.2 DO-stat

La estrategia DO-stat regula indirectamente el suministro de metanol controlando el oxígeno disuelto para mantener la oxigenación, pero no fija la concentración de metanol y la tasa de crecimiento, lo cual puede afectar el estudio de la expresión de proteínas. La oxigenación plantea un desafío en la fermentación aeróbica, y aunque la suplementación de oxígeno puro puede ser costosa y tóxica, el aumento de la presión es un enfoque más económico que también puede mejorar la actividad de las proteínas.

1.3 Metanol-stat

Un control inadecuado de la concentración de metanol impone limitaciones a ambas estrategias de μ-stat y DO-stat. Las estrategias estadísticas de metanol, que operan en un modo de encendido/apagado, son propensas a fluctuaciones y carecen de precisión. En contraste, los controladores PID ofrecen una regulación más precisa de la concentración de metanol, mejorando la efectividad general de la fermentación.

1.4 Biomasa-stat

La estrategia biomass-stat define la relación entre la biomasa y el suministro de metanol, optimizando la tasa de alimentación de metanol para mejorar el rendimiento de proteínas. El monitoreo en línea de la biomasa es más práctico, con citometría de flujo siendo el método preferido. A escala de 1000L, optimizar la tasa de alimentación de metanol mejora significativamente la actividad enzimática, el rendimiento y la productividad, superando la fermentación en frascos.

Estrategia de co-alimentación

El glicerol, como inhibidor del promotor AOX1, debe ser completamente consumido antes de la inducción con metanol para evitar suprimir la producción de proteínas. Los co-sustratos pueden mejorar la actividad enzimática, pero un exceso de glicerol puede dañar el crecimiento y la expresión. La sorbitol, el ácido ascórbico, el manitol y otros pueden sustituir al glicerol, reduciendo la proteólisis y el tiempo de cultivo, y mejorando la expresión de proteínas.

El banco de cepas requiere adoptar métodos de conservación adecuados y su colocación en un entorno apropiado para mantener la estabilidad de las características de las cepas. Yaohai Bio-Pharma puede satisfacer los requisitos para la preservación en caldo de glicerol (a través de congeladores de ultra-bajo temperatura o nitrógeno líquido) y la preservación por liofilización de levaduras y E. coli.

Estrategia inducida por restricción

En Pichia pastoris, condiciones restrictivas como baja DO, concentración de metanol y límite de oxígeno aumentan la expresión de proteínas recombinantes. Las condiciones con límite de oxígeno activan el promotor AOX1 mediante la acumulación de metanol, incrementando la producción de proteínas mientras reducen el calor. La inducción a bajas temperaturas mejora el rendimiento, actividad, estabilidad y viabilidad celular, pero añade costos de enfriamiento. El pH y la limitación de nitrógeno también ayudan en la expresión, requiriendo precaución para evitar problemas operativos. La limitación de nitrógeno mejora notablemente la productividad específica de proteínas.

Yaohai Bio-Pharma también está buscando activamente socios globales institucionales o individuales y ofrece la compensación más competitiva del sector. Si tiene alguna pregunta, no dude en ponerse en contacto con nosotros: BD@yaohaibio.cn