Aprovechar el poder de la estrategia de fermentación por lotes

La Pichia pastoris se utiliza ampliamente en la producción de diversas proteínas heterólogas. La tecnología de fermentación de alta densidad celular (HCDF), implementada mediante alimentación por lotes, ha logrado con éxito la producción a gran escala de productos biofarmacéuticos y enzimas industriales. En medios controlados con precisión, la utilización de la tecnología HCDF puede obtener proteínas recombinantes de alto rendimiento, alta actividad y rentables.

Investigaciones recientes indican que, mediante estrategias HCDF, se están realizando esfuerzos para aumentar la producción y la actividad de proteínas heterólogas en Pichia pastoris. La tecnología HCDF permite la obtención sin esfuerzo de agrupaciones de células de alto nivel en medios definidos, lo que permite la adquisición de proteínas recombinantes abundantes con actividad mejorada y costos reducidos mediante HCDF. Sin embargo, la selección de la estrategia HCDF adecuada para optimizar la expresión de alto nivel de proteínas específicas en Pichia pastoris sigue siendo un desafío.

Fermentación de alta densidad celular (HCDF)

Pichia pastoris se destaca en la producción de proteínas heterólogas, favorecida por la HCDF en biorreactores automatizados. La HCDF tiene 3 etapas: lote de glicerol, alimentación e inducción de metanol. Yaohai Bio-Pharma cuenta con más de una década de experiencia en fermentación microbiana y ha prestado servicios en más de 400 proyectos. La empresa posee una amplia experiencia y una tecnología bien desarrollada, lo que le permite utilizar varias estrategias de HCDF para mejorar la eficiencia de la producción de proteínas.

El metanol actúa como inductor de AOX1 y como fuente de carbono, pero su concentración debe controlarse para evitar la toxicidad. La evaluación de diferentes estrategias de alimentación con metanol es crucial para optimizar el crecimiento de Pichia pastoris y la expresión de proteínas.

Estrategia de inducción de metanol

En la estrategia de inducción de metanol con HCDF por lotes alimentados, las estrategias de inducción basadas en estados abarcan un conjunto de metodologías de control que regulan la adición suplementaria de metanol a través de un control en línea/fuera de línea o hacia adelante/atrás. Entre las estrategias de inducción estadística, las principales incluyen μ-stat, oxígeno disuelto (OD)-stat, metanol-stat y biomasa-stat.

1.1 μ-stat

La estrategia μ-stat mantiene estable la biomasa controlando μ, lo que favorece la reproducibilidad y estudia el efecto de μ en la expresión de proteínas. Sin embargo, carece de control directo del metanol y el oxígeno disuelto, lo que supone un riesgo de acumulación y generación de ROS.

1.2 DO-estadístico

La estrategia DO-stat regula indirectamente la alimentación de metanol al controlar el oxígeno disuelto para mantener la oxigenación, pero no fija la concentración de metanol ni la tasa de crecimiento, lo que puede afectar el estudio de la expresión de proteínas. La oxigenación plantea un desafío en la fermentación aeróbica y, si bien la suplementación de oxígeno puro puede ser costosa y tóxica, la mejora de la presión es un enfoque más económico que también puede mejorar la actividad de las proteínas.

1.3 Metanol-stato

El control inadecuado de la concentración de metanol plantea limitaciones tanto a las estrategias μ-stat como a las estrategias DO-stat. Las estrategias estadísticas de metanol, que funcionan en modo encendido/apagado, son propensas a fluctuaciones y carecen de precisión. Por el contrario, los controladores PID ofrecen una regulación más precisa de la concentración de metanol, lo que mejora la eficacia general de la fermentación.

1.4 Estadísticas de biomasa

La estrategia de biomasa-estadística define la relación entre la biomasa y la alimentación de metanol, optimizando la tasa de alimentación de metanol para mejorar el rendimiento proteico. El monitoreo en línea de la biomasa es más práctico, siendo la citometría de flujo el método preferido. A una escala de 1000L, optimizar la tasa de alimentación de metanol mejora significativamente la actividad enzimática, el rendimiento y la productividad, superando la fermentación en matraz.

Estrategia de co-alimentación

El glicerol, como inhibidor del promotor AOX1, debe consumirse por completo antes de la inducción con metanol para evitar la supresión de la producción de proteínas. Los cosustratos pueden mejorar la actividad enzimática, pero el exceso de glicerol puede perjudicar el crecimiento y la expresión. El sorbitol, el ácido ascórbico, el manitol y otros pueden sustituir al glicerol, lo que reduce la proteólisis y el tiempo de cultivo y mejora la expresión de proteínas.

El banco de cepas requiere la adopción de métodos de conservación adecuados y su colocación en un entorno adecuado para mantener la estabilidad de las características de la cepa. Yaohai Bio-Pharma puede cumplir con los requisitos de conservación de glicerol (mediante congeladores de temperatura ultrabaja o nitrógeno líquido) y la conservación por liofilización de levaduras y E. coli.

Estrategia inducida por restricciones

En Pichia pastoris, las condiciones restrictivas como el bajo contenido de oxígeno disuelto, la concentración de metanol y el límite de oxígeno estimulan la expresión de proteínas recombinantes. Las condiciones limitadas de oxígeno activan el promotor AOX1 a través de la acumulación de metanol, lo que aumenta la producción de proteínas y reduce el calor. La inducción a baja temperatura mejora el rendimiento, la actividad, la estabilidad y la viabilidad celular, pero agrega costos de enfriamiento. La limitación de nitrógeno y pH también ayuda a la expresión, lo que requiere precaución para evitar problemas operativos. La limitación de nitrógeno mejora notablemente la productividad de proteínas específicas.

Yaohai Bio-Pharma también busca activamente socios globales institucionales o individuales y ofrece la remuneración más competitiva de la industria. Si tiene alguna pregunta, no dude en contactarnos: [email protected]