Příprava mRNA IVT

In vitro transkripcí (IVT) je preferovanou metodou pro přípravu mRNA, která dokáže vytvořit mikrogramy až miligramy mRNA na laboratorní úrovni. Pro výzkumné účely vyvinuli dodavatelé reagentů univerzální IVT systémy reakcí vhodné pro mRNA střední délky (1000-4000 nukleotidů).

V tomto článku shrneme in vitro transkripci (IVT) mRNA, včetně běžného systému IVT reakce používaného na laboratorní úrovni a systému IVT reakce vhodného pro ultra-dlouhou mRNA (>9000 nukleotidů).

Sady umožňují současnou zakončovací modifikaci pomocí CleanCap AG a snižují imunogennost pomocí m1ψ. DNase I odstraní zbylé DNA. Nízký výnos může být způsoben špatným mícháním, oxidací reagentů nebo problémy s DNA šablonou, což lze zmírnit centrifugací, čerstvými reagenty, kontrolami a úpravou množství šablony/času reakce.

Yaohai Bio-Pharma nabízí různé předem připravené produkty IVT RNA (kapalina/vyzařovaný prášek) a LNP dokončené produkty, které kódují proteiny jako jsou fluorescenční proteiny (eGFP, mCHERRY), luciferáza, rekombináza Cre a antigen OVA, aby bylo možné splnit různé experimentální nebo projektové potřeby.

Systém IVT pro ultradlouhé mRNA

Konvenční IVT nemusí fungovat pro příliš dlouhé mRNA (>9000 nt). Je třeba hlubokého porozumění a rozumné úpravy složek IVT.

DNA šablona: Linearizované plazmidy nebo PCR produkty s odpovídajícími sékvencemi promotoru, rozpouštěné v RNase-free H2O. Pro optimální podmínky IVT je doporučena koncentrace DNA šablony vyšší než 40 nM.

DTT: Udržuje enzymatickou aktivitu během transkripcí. Do reakčního roztoku by měl být přidán čerstvý DTT pro optimální enzymatickou aktivitu.

Inhibitor RNase: Inhibuje aktivitu RNase a udržuje stabilitu mRNA.

T7 RNA polymeráza: Katalyzuje transkripci DNA do RNA, která odpovídá promotorové sekvenci. Aktivita polymerázy T7 RNA je ovlivněna pH a magneziovými ionty.

Magneziové ionty (Mg2+): Kofaktor pro RNA polymerázu. Příliš nízké koncentrace snižují účinnost transkripce, zatímco příliš vysoké koncentrace vedou k degradaci RNA. Volná koncentrace [Mg2+] by měla být upravena podle koncentrace nukleotidů. Každý nukleotid šlape jeden [Mg2+], takže koncentrace [Mg2+] by měla převyšovat celkovou koncentraci nukleotidů.

Nukleosidofosfát triphosphorylové (NTP): Jako substráty jsou NTP základními jednotkami RNA. Koncentrace NTP nad 7 mM mají pozitivní vliv na produkci mRNA.

Spermidin: Stabilizuje DNA-enzymové komplexy a stimuluje transkripční reakce; však příliš vysoké koncentrace mají inhibiční účinky. Doporučená koncentrace spermidinu je mezi 1 a 3 mM.

Inorganická pyrofosfatáza (PPase): Přidáno do reakcí IVT pro prevenci akumulace iontů inorganického pyrofosfátu (PPi), čímž se zabrání jejich chelaci s Mg2+ a zajistí dostatek volného Mg2+.

S využitím průkopnické technologie a zkušeností s IVT mRNA nabízí Yaohai Bio-Pharma kompletní službu IVT RNA, která zahrnuje návrh sekvence, přípravu IVT RNA (s modifikacemi m1ψ), cyklikaci RNA, očištění, lyofilizaci, encapsulaci LNP a kvalitní testování.

Hledáme také aktivně globální partnery, jak institucionální, tak jednotlivce. Nabízíme nejvyšší odškodnění v odvětví. Pokud máte jakékoli otázky, neváhejte nás kontaktovat: [email protected]