Příprava IVT mRNA

In vitro transkripce (IVT) je preferovaný způsob přípravy mRNA, schopný poskytnout mikrogramy až miligramy mRNA v laboratorním měřítku. Pro výzkumné účely vyvinuli dodavatelé činidel všestranné IVT reakční systémy vhodné pro mRNA střední délky (1000-4000 nukleotidů).

V tomto článku shrneme in vitro transkripci (IVT) mRNA, včetně konvenčního reakčního systému IVT používaného v laboratorním měřítku a reakčního systému IVT vhodného pro ultradlouhé mRNA (>9000 nukleotidů).

Soupravy umožňují ko-transkripční překrytí s CleanCap AG a snižují imunogenicitu pomocí m1ψ. DNáza I odstraňuje zbytkovou DNA. Nízký výtěžek může být způsoben špatným mícháním, oxidací činidel nebo problémy s templátem DNA, které lze zmírnit centrifugací, čerstvými činidly, kontrolami a úpravou množství templátu/reakční doby.

Yaohai Bio-Pharma poskytuje různé prefabrikované IVT RNA produkty (tekutý/lyofilizovaný prášek) a LNP hotové produkty, kódující proteiny, jako jsou fluorescenční proteiny (eGFP, mCHERRY), luciferáza, rekombináza Cre a antigen OVA, pro splnění různých experimentů nebo projektů. potřeby.

IVT systém pro ultradlouhou mRNA

Konvenční IVT nemusí fungovat pro příliš dlouhou mRNA (>9000 nt). Je zapotřebí hluboké porozumění a racionální přizpůsobení komponent IVT.

DNA šablona: Linearizované plazmidy nebo produkty PCR s odpovídajícími promotorovými sekvencemi rozpuštěné v H2O bez RNázy. Pro optimální podmínky IVT se doporučuje koncentrace templátu DNA vyšší než 40 nM.

DTT: Udržuje aktivitu enzymu během transkripce. Čerstvý DTT by měl být přidán do reakčního pufru pro optimální aktivitu enzymu.

Inhibitor RNázy: Inhibuje aktivitu RNázy a udržuje stabilitu mRNA.

T7 RNA polymeráza: Katalyzuje transkripci DNA do RNA, odpovídající sekvenci promotoru. Aktivita T7 RNA polymerázy je ovlivněna pH a ionty hořčíku.

Hořčíkové ionty (Mg2+): Kofaktor pro RNA polymerázu. Příliš nízké koncentrace snižují účinnost transkripce, zatímco příliš vysoké koncentrace vedou k degradaci RNA. Volný [Mg2+] by měl být upraven na základě koncentrace nukleotidů. Každý nukleotid chelatuje jeden [Mg2+], takže koncentrace [Mg2+] by měla překročit celkovou koncentraci nukleotidů.

Nukleosidtrifosfáty (NTP): Jako substráty jsou NTP základními jednotkami RNA. Koncentrace NTP nad 7 mM mají pozitivní dopad na produkci mRNA.

Spermidin: Stabilizuje komplexy DNA-enzym a stimuluje transkripční reakce; nadměrné koncentrace však mají inhibiční účinky. Doporučená koncentrace spermidinu je mezi 1 a 3 mM.

Anorganická pyrofosfatáza (PPáza): Přidáno do IVT reakcí, aby se zabránilo hromadění anorganických pyrofosfátových iontů (PPi), aby se zabránilo jejich chelaci s Mg2+ a zajistily dostatek volného Mg2+.

Yaohai Bio-Pharma s využitím průkopnické technologie a zkušeností s IVT mRNA poskytuje jednorázovou službu IVT RNA, která zahrnuje návrh sekvence, přípravu IVT RNA (s mody m1ψ), cyklizaci RNA, purifikaci, lyofilizaci, zapouzdření LNP a testování kvality.

Aktivně také hledáme institucionální nebo individuální globální partnery. Nabízíme nejkonkurenceschopnější kompenzaci v oboru. Máte-li jakékoli dotazy, neváhejte nás kontaktovat: [email protected]