Využití síly strategie fed-batch fermentace

Pichia pastoris je široce používána v produkci různých heterologních bílkovin. Technologie fermentace s vysokou hustotou buněk (HCDF), implementovaná prostřednictvím krmivého režimu Fed-Batch, úspěšně dosáhla velkého měřítka produkce biolfarmaceutik a průmyslových enzymů. V přesně kontrolovaném prostředí lze pomocí technologie HCDF získat vysoké výsledky, aktivitu a nákladově efektivní rekombinantní bílkoviny.

Nedávná výzkumná data ukazují, že prostřednictvím strategií HCDF se usiluje o zvýšení produkce a aktivity heterologních bílkovin v Pichia pastoris. Technologie HCDF umožňuje snadné dosažení vysokého stupeň clusteru buněk v definovaném prostředí, čímž umožňuje získat bohaté rekombinantní bílkoviny s posílenou aktivitou a sníženými náklady prostřednictvím HCDF. Nicméně, volba vhodné strategie HCDF pro optimalizaci vysoké expresivity specifických bílkovin v Pichia pastoris stále zůstává výzvou.

Fermentace s vysokou hustotou buněk (HCDF)

Pichia pastoris vyniká ve výrobě heterologických bílkovin, oblíbená pro HCDF v automatizovaných bioreaktorech. HCDF má 3 fáze: dávkování glycerolem, krmení a indukce methanolem. Yaohai Bio-Pharma se pyšní více než desetiletou zkušeností s mikrobiálním fermentováním a poskytla služby přes 400 projektům. Společnost disponuje rozsáhlou expertizou a dobře vyvinutou technologií, která jí umožňuje používat různé strategie HCDF k zvýšení efektivity produkce bílkovin.

Methanol slouží jako induktor AOX1 i jako uhlíkový zdroj, ale jeho koncentrace musí být řízena, aby se zabránilo toxickému účinku. Hodnocení různých strategií krmení methanolem je klíčové pro optimalizaci růstu Pichia pastoris a expresi bílkovin.

Strategie indukce methanolem

V strategii indukce methanolového HCDF v režimu fed-batch zahrnují stavově založené indukční strategie sadu metodických přístupů, které regulují doplňkové přidávání methanolu prostřednictvím online/offline nebo vpřed/zpět řízení. Mezi statistickými indukčními strategiemi patří hlavně μ-stat, Dissolved Oxygen (DO)-stat, methanol-stat a biomass-stat.

1.1 μ-stat

strategie μ-stat udržuje biomasy stabilní řízením μ, což pomáhá k reprodukovatelnosti a studiu vlivu μ na expresi bílkovin. Nicméně chybí přímá kontrola methanolu a DO, čímž je riskováno akumulace a generování ROS.

1.2 DO-stat

Strategie DO-stat nepřímo reguluje přísun methanolu řízením disovaného kyslíku pro udržení oksigenace, ale nespravuje koncentraci methanolu a růstovou sazbu, což může ovlivnit studium expresních proteinů. Oxsigenace představuje výzvu v aerobní fermentaci a i když doplnění čistého kyslíku může být nákladné a toxické, zvýšení tlaku je ekonomičtější přístup, který může také posílit aktivitu proteinu.

1.3 Methanol-stat

Nedostatečná kontrola koncentrace methanolu představuje omezení jak pro strategii μ-stat, tak pro strategii DO-stat. Methanolové statistické strategie, které fungují v režimu zapnutí/vypnutí, jsou náchylné k fluktuacím a chybí jim přesnost. Naopak PID regulátory nabízejí přesnější regulaci koncentrace methanolu, což zvyšuje celkovou účinnost fermentace.

1.4 Biomasa-stat

Strategie biomass-stat definuje vztah mezi biomasou a podáváním methanolu, optimalizací rychlosti podávání methanolu zvyšuje výnos bílkovin. Online monitorování biomasy je praktičtější, přičemž metodou volby je cytofluorimetrie. U měřítka 1000L významně optimalizace rychlosti podávání methanolu zlepšuje enzymovou aktivitu, výnos a produktnost, překonávajíc flésovou fermentaci.

Strategie společného krmení

Glycerol, jako inhibitor promotoru AOX1, musí být úplně spotřebován před indukcí methanolu, aby se zabránilo potlačování produkce bílkovin. Společné substráty mohou zvýšit enzymovou aktivitu, ale přebytek glycerolu může škodit růstu a expresi. Sorbitol, askorbová kyselina, manitol a další mohou nahradit glycerol, což snižuje proteolýzu a dobu kultivace a zvyšuje expresi bílkovin.

Banka šťáv vyžaduje přijetí vhodných metod konzervace a umístění do vhodného prostředí pro udržení stability vlastností šťáv. Yaohai Bio-Pharma může splnit požadavky na konzervaci glycerolového zásobníku (pomocí mrazicích skříní s extrémně nízkou teplotou nebo kapalným dusíkem) a konzervaci sušením pod vakuem kvasinek a E. coli.

Strategie indukovaná omezením

V Pichia pastoris zvyšují omezené podmínky, jako jsou nízké DO, koncentrace methanolu a omezení kyslíku, expresi rekombinantních bílkovin. Podmínky s omezením kyslíku aktivují promotor AOX1 prostřednictvím akumulace methanolu, čímž zvyšují výstup bílkovin a současně snižují teplo. Indukce nízkou teplotou zvyšuje výnos, aktivitu, stabilitu a životaschopnost buněk, ale přidává náklady na chlazení. Omezování pH a dusíku také podporuje expresi, přičemž je třeba být opatrný, aby se zabránilo provozním problémům. Omezení dusíku znamenatelně zvyšuje specifickou produkci bílkovin.

Yaohai Bio-Pharma aktivně hledá globální partnery, jak institucionální, tak individuální, a nabízí nejvyšší odměny v odvětví. Pokud máte jakékoliv otázky, neváhejte nás kontaktovat: [email protected]