Využití síly strategie Fed-batch fermentace

Pichia pastoris se široce používá při výrobě různých heterologních proteinů. Technologie fermentace s vysokou hustotou buněk (HCDF), implementovaná prostřednictvím Fed-Batch krmení, úspěšně dosáhla výroby biofarmaceutik a průmyslových enzymů ve velkém měřítku. V přesně řízených médiích může využití technologie HCDF získat vysoce výtěžné, vysoce aktivní a cenově výhodné rekombinantní proteiny.

Nedávný výzkum ukazuje, že prostřednictvím strategií HCDF se vyvíjí úsilí ke zvýšení produkce a aktivity heterologních proteinů v Pichia pastoris. Technologie HCDF umožňuje snadné dosažení buněčných shluků na vysoké úrovni v definovaných médiích, čímž umožňuje získání hojných rekombinantních proteinů se zvýšenou aktivitou a sníženými náklady prostřednictvím HCDF. Výběr vhodné strategie HCDF pro optimalizaci vysoké úrovně exprese specifických proteinů v Pichia pastoris však zůstává výzvou.

Fermentace s vysokou buněčnou hustotou (HCDF)

Pichia pastoris vyniká v produkci heterologních proteinů, upřednostňovaných pro HCDF v automatizovaných bioreaktorech. HCDF má 3 stupně: dávku glycerolu, přívod a indukci methanolem. Yaohai Bio-Pharma se může pochlubit více než desetiletými zkušenostmi s mikrobiální fermentací a sloužila více než 400 projektům. Společnost má rozsáhlé odborné znalosti a dobře vyvinuté technologie, které jí umožňují využívat různé strategie HCDF ke zlepšení účinnosti produkce proteinů.

Metanol slouží jak jako induktor AOX1, tak jako zdroj uhlíku, ale jeho koncentrace musí být kontrolována, aby se zabránilo toxicitě. Pro optimalizaci růstu Pichia pastoris a exprese proteinů je zásadní vyhodnocení různých strategií podávání methanolu

Strategie navození methanolu

Ve strategii indukce methanolu HCDF s přítokem zahrnují strategie indukce založené na stavu sadu kontrolních metodologií, které regulují doplňkové přidávání metanolu prostřednictvím online/offline nebo dopředného/zpětného řízení. Mezi strategie statistické indukce patří mezi hlavní strategie μ-stat, Dissolved Oxygen (DO)-stat, methanol-stat a biomass-stat.

1.1 μ-stat

Strategie μ-stat udržuje biomasu stabilní tím, že kontroluje μ, napomáhá reprodukovatelnosti a studuje vliv μ na expresi proteinů. Postrádá však přímou kontrolu methanolu a DO, což riskuje akumulaci a tvorbu ROS.

1.2 DO-stat

Strategie DO-stat nepřímo reguluje přívod methanolu řízením rozpuštěného kyslíku, aby se udržela oxygenace, ale nefixuje koncentraci methanolu a rychlost růstu, což může ovlivnit studium exprese proteinu. Okysličování představuje výzvu v aerobní fermentaci, a zatímco suplementace čistého kyslíku může být nákladná a toxická, zvýšení tlaku je ekonomičtější přístup, který může také zvýšit aktivitu proteinů.

1.3 Methanol-stat

Nedostatečná kontrola koncentrace metanolu představuje omezení pro strategie μ-stat i DO-stat. Metanolové statistické strategie, které fungují v režimu zapnuto/vypnuto, jsou náchylné k výkyvům a postrádají přesnost. Naproti tomu PID regulátory nabízejí přesnější regulaci koncentrace metanolu, čímž zvyšují celkovou účinnost fermentace.

1.4 Biomasa-stat

Strategie biomasy-stat definuje vztah mezi biomasou a přísunem metanolu, optimalizuje rychlost přivádění metanolu pro zvýšení výtěžku bílkovin. Praktičtější je online monitorování biomasy, preferovanou metodou je průtoková cytometrie. V měřítku 1000 l optimalizace rychlosti dávkování methanolu výrazně zlepšuje enzymatickou aktivitu, výtěžek a produktivitu, čímž překonává fermentaci v baňkách.

Strategie společného krmení

Glycerol jako inhibitor promotoru AOX1 musí být před indukcí methanolem plně spotřebován, aby nedošlo k potlačení produkce proteinu. Kosubstráty mohou zvýšit aktivitu enzymu, ale nadbytek glycerolu může poškodit růst a expresi. Sorbitol, kyselina askorbová, mannitol a další mohou nahradit glycerol, zkrátit proteolýzu a dobu kultivace a zvýšit expresi proteinů.

Kmenová banka vyžaduje přijetí vhodných konzervačních metod a umístění do vhodného prostředí, aby byla zachována stabilita charakteristik kmene. Yaohai Bio-Pharma může splnit požadavky na konzervaci glycerolových zásob (pomocí ultranízkoteplotních mrazniček nebo tekutého dusíku) a konzervaci kvasinek a E. coli sušením mrazem.

Strategie vyvolaná restrikcí

U Pichia pastoris zesilují omezující podmínky, jako je nízká koncentrace DO, koncentrace metanolu a limit kyslíku, expresi rekombinantního proteinu. Podmínky s omezeným množstvím kyslíku aktivují promotor AOX1 prostřednictvím akumulace methanolu, čímž se zvyšuje produkce proteinů a zároveň se snižuje teplo. Nízkoteplotní indukce zvyšuje výtěžnost, aktivitu, stabilitu a životaschopnost buněk, ale zvyšuje náklady na chlazení. Omezení pH a dusíku také napomáhá expresi, což vyžaduje opatrnost, aby se předešlo provozním problémům. Omezení dusíku výrazně zvyšuje produktivitu specifických proteinů.

Yaohai Bio-Pharma také aktivně hledá institucionální nebo individuální globální partnery a nabízí nejkonkurenceschopnější kompenzaci v oboru. Máte-li jakékoli dotazy, neváhejte nás kontaktovat: [email protected]