Підготовка IVT mRNA

Транскрипція in vitro (IVT) є переважним методом для підготовки mRNA, який може давати мікrogramи до міліgramів mRNA в лабораторних умовах. Для наукових досліджень постачальники реагентів розробили гнучкі системи реакцій IVT, придатні для mRNA середньої довжини (1000-4000 нуклеотидів).

У цій статті ми підсумуємо транскрипцію mRNA in vitro (IVT), включаючи традиційну систему реакцій IVT, яка використовується на лабораторному рівні, і систему реакцій IVT, придатну для ультрадовгого mRNA (>9000 нуклеотидів).

Комплекти дозволяють співтранскрипційне капування за допомогою CleanCap AG і зменшують імуногенність за допомогою m1ψ. DNase I видаляє залишковий DNA. Низька видача може бути пов'язана з поганою перемішуванням, окисленням реагентів або проблемами з DNA-шаблоном, що можна уникнути шляхом центрування, свіжих реагентів, контролю та регулювання кількості шаблону/часу реакції.

Yaohai Bio-Pharma пропонує різні готові продукти IVT RNA (рідина/заморожений порошок) та ЛНП, які кодують протеїни, такі як флуоресцентні протеїни (eGFP, mCHERRY), люцифераза, рекомбіназа Cre та антиген OVA, щоб задовольнити різні експериментальні або проектні потреби.

Система IVT для ультрадовгого mRNA

Звичайна IVT може не працювати для надто довгих мРНК (>9000 нт). Потрібно глибше зрозуміння та раціональна корекція компонентів IVT.

ДНК-шаблон: Лінеаризовані плазміди чи продукти PCR з відповідними послідовностями промоторів, розчинені в RNase-вільній H2O. Для оптимальних умов IVT рекомендується концентрація ДНК-шаблону більше 40 нМ.

DTT: Підтримує активність ензимів під час транскрипції. До реакційного буфера слід додавати свіжий DTT для оптимальної активності ензимів.

Інгібітор RNase: Інгібує активність RNase та підтримує стійкість мРНК.

Полімераза T7 RNA: Каталізує транскрипцію ДНК у РНК, що відповідає секвенції промотора. Активність полімерази РНК T7 залежить від рН і іонів магнію.

Іони магнію (Mg2+): Кофактор для полімерази РНК. Занадто низькі концентрації зменшують ефективність транскрипції, а занадто високі призводять до деградації РНК. Вільний [Mg2+] повинен бути встановлений на основі концентрації нуклеотидів. Кожен нуклеотид хелатує один [Mg2+], тому концентрація [Mg2+] має перевищувати загальну концентрацію нуклеотидів.

Трифосфати нуклеозидів (NTP): Як субстрати, NTP є базовими одиницями РНК. Концентрації NTP вище 7 mM мають позитивний вплив на виробництво мРНК.

Спермідин: Стабілізує комплекс ДНК-ензим і стимулює реакції транскрипції; однак, занадто високі концентрації мають тормозний ефект. Рекомендована концентрація спермідину становить від 1 до 3 mM.

Пірофосфатаза (PPase): Додано до реакцій IVT, щоб запобігти накопиченню іонів органофосфату (PPi), уникнувши їх хелатації з Mg2+ та забезпечуючи достатню кількість вільного Mg2+.

Використовуючи передову технологію та досвід IVT mRNA, Yaohai Bio-Pharma надає повний спектр послуг з IVT RNA, включаючи проектування послідовностей, підготовку IVT RNA (з модифікаціями m1ψ), циклізацію RNA, очищення, ліофілізацію, енкапсуляцію LNP та тестування якості.

Ми також активно шукаємо глобальних партнерів серед установ або окремих осіб. Ми пропонуємо найбільш конкурентоспроможну компенсацію в галузі. Якщо в вас є будь-які питання, будь ласка, не соромтеся звертатися до нас: [email protected]