Приготування мРНК IVT

Транскрипція in vitro (IVT) є кращим методом для отримання мРНК, здатного давати від мікрограмів до міліграмів мРНК у лабораторних масштабах. Для дослідницьких цілей постачальники реагентів розробили універсальні реакційні системи IVT, придатні для мРНК середньої довжини (1000-4000 нуклеотидів).

У цій статті ми підсумуємо транскрипцію in vitro (IVT) мРНК, включаючи звичайну реакційну систему IVT, що використовується в лабораторних масштабах, і реакційну систему IVT, придатну для наддовгих мРНК (>9000 нуклеотидів).

Набори забезпечують котранскрипційне кепування за допомогою CleanCap AG і знижують імуногенність за допомогою m1ψ. ДНКаза I видаляє залишки ДНК. Низький вихід може бути спричинений поганим змішуванням, окисленням реагентів або проблемами з матрицею ДНК, які можна пом’якшити центрифугуванням, свіжими реагентами, контролями та коригуванням кількості матриці/часу реакції.

Yaohai Bio-Pharma надає різні збірні продукти IVT РНК (рідкий/ліофілізований порошок) і готові продукти LNP, що кодують білки, такі як флуоресцентні білки (eGFP, mCHERRY), люцифераза, рекомбіназа Cre та антиген OVA, щоб відповідати різним експериментальним або проектним потреби.

Система IVT для наддовгих мРНК

Звичайна IVT може не працювати для надто довгої мРНК (>9000 нт). Необхідне глибоке розуміння та раціональне налаштування компонентів IVT.

Шаблон ДНК: Лінеаризовані плазміди або продукти ПЛР з відповідними промоторними послідовностями, розчиненими у H2O, вільній від РНКази. Для оптимальних умов IVT рекомендована концентрація ДНК-матриці вище 40 нМ.

DTT: Підтримує активність ферменту під час транскрипції. Свіжий DTT слід додати до реакційного буфера для оптимальної активності ферменту.

Інгібітор РНКази: Пригнічує активність РНКази та підтримує стабільність мРНК.

Т7 РНК-полімераза: Каталізує транскрипцію ДНК в РНК, відповідну послідовності промотора. На активність РНК-полімерази Т7 впливають рН та іони магнію.

Іони магнію (Mg2+): Кофактор РНК-полімерази. Занадто низькі концентрації знижують ефективність транскрипції, тоді як надто високі концентрації призводять до деградації РНК. Вільний [Mg2+] слід регулювати на основі концентрації нуклеотидів. Кожен нуклеотид хелатує один [Mg2+], тому концентрація [Mg2+] повинна перевищувати загальну концентрацію нуклеотидів.

Нуклеозидтрифосфати (NTP): Як субстрати NTP є основними одиницями РНК. Концентрація NTP вище 7 мМ позитивно впливає на виробництво мРНК.

спермідин: Стабілізує ДНК-ферментні комплекси і стимулює реакції транскрипції; однак надмірні концентрації мають гальмівний ефект. Рекомендована концентрація спермідину становить від 1 до 3 мМ.

Неорганічна пірофосфатаза (PPase): Додається до реакцій IVT, щоб запобігти накопиченню неорганічних пірофосфат-іонів (PPi), уникаючи їх хелатування з Mg2+ і забезпечуючи достатню кількість вільного Mg2+.

Використовуючи передову технологію та досвід мРНК IVT, Yaohai Bio-Pharma надає комплексні послуги IVT РНК, що охоплюють розробку послідовності, підготовку РНК IVT (з модами m1ψ), циклізацію РНК, очищення, сублімаційне сушіння, інкапсуляцію LNP та перевірку якості.

Ми також активно шукаємо інституційних або індивідуальних глобальних партнерів. Ми пропонуємо найконкурентнішу компенсацію в галузі. Якщо у вас виникли запитання, зв’яжіться з нами: CRO@yaohaibio.cn