Wat de massa-productie van mRNA betreft, is in vitro transcriptie (IVT) een efficiëntere en volwassenere methode. De IVT-reactie gebruikt lineariseerd plasmid-DNA dat de T7-promotor bevat als sjabloon, en mRNA wordt gesynthetiseerd met nucleoside triphosphates (NTPs) als substraten in aanwezigheid van T7 RNA-polymerase.
Nucleotide-modificatie is een doorbraak in het onderzoek naar mRNA, waarbij niet-gemodificeerde mRNA-moleculen worden herkend door intracellulaire RNA-sensoren om de aangeborene immuniteit te activeren. Om rekening te houden met de in vivo immunogeniteit van mRNA en de vertaal-efficiëntie, maakt het IVT-proces gewoonlijk gebruik van bepaalde soorten gemodificeerde NTPs, en gangbare gemodificeerde nucleotiden zijn pseudouridine (Ψ), N1-methyl-pseudouridine (N1Ψ) en 5-methylcytosine (5mC).

In Vitro Transcriptieproces van mRNA

Schematische weergave van de in vitro transcriptie (IVT)-reactie
Service Details
Optionele Diensten |
Service Details |
Leveringsperiode (werkdag) |
Transcriptie in vitro (IVT) |
IVT, In vitro transcriptie |
1 |
Nucleotiden modificaties (Ψ/N1Ψ/5mC, etc.) |
DNA-sjabloon verwijdering (DNase I) |
Optimalisatie van IVT-condities - optioneel |
Ontwerp en optimalisatie van IVT-reactiecomponenten |
2-5 |
Onze functies
- Verscheiden Nucleotide Modificatie Strategieën
Verbeter de stabiliteit van mRNA en eiwitsynthese in vivo.
- Strikt Testontwerp en Optimalisatie
de voorbereiding van mRNA-fracties tot 10kb kan bereikt worden.
Door de IVT-reactiecondities te optimaliseren, is de transscriptiesnelheid tot 1:200.
- Streng controle van RNase
Strenge controle van RNase door middel van een experimentele omgeving en verbruiksartikelen kan effectief mRNA-degradatie voorkomen.
Gevalstudie
Het huidige IVT-reactiesysteem is ongeveer geoptimaliseerd voor synthetische systemen met een lengte van ongeveer 100 nt, niet voor mRNA's van willekeurige lengte. Hoe langer de mRNA-sequentie, des te moeilijker is het om te transcriberen en des te gevoeliger is het voor degradatie.
Om aangepaste mRNA-sequenties met een lengte van ongeveer 10 kb voor te bereiden, heeft Yaohai Bio-Pharma succesvol hoge-kwaliteitsmonsters voorbereid met een hoge transcriptieratio van 1:135 en verkregen 135 μg van oorspronkelijk gezuiverde mRNA-producten nadat 1 μg van gelineaireerd plasmid in vitro was getranscribeerd door streng experimenteel ontwerp, continue optimalisatie van reactiecondities en strikte controle van RNase.

mRNA identificeren (Agarose Gel Electrophorese)